Способ определения адгезивных свойств микроорганизмов,вызывающих кишечные инфекции Советский патент 1984 года по МПК C12N1/00 

Изобретение относится к медицинской микробиологии и касается изучения вирулентных свойств микроорганизмов...

Известен способ определения адгезивных свойств микроорганизмов путем контактирования исследуемой культуры с кусочками ткани кишечника в буферном растворе, после чего определяют индекс адгезии Л .

Известен также способ определения адгезибных свойств микроорганизмов, вызывающих кишечные инфекции, путем введения исследуемой культуры в живой организм - изолированные петли тонкой кишки взрослого кролика с последующим определением адгезивных свойств по индексу адгезии 2 .

Однако известные способы длительны и не обеспечивают высокой точности определения, так как предусматривают оценку только одного показателя - индекса адгезии.

Целью изобретения является ускр.рение и првьшение точности способа.i

Цель достигается тем, что согласн способу определения адгезионных свойств микроорганизмов, вызывающих кишечные инфекции, пзтем введения. исследуемой культуры в живой организм с последующим определением адгезионных свойств по индексу адгезии, исследуемую культуру вводят в аллантоисную полость развивающихся куриных эмбрионов, инкубируют в течение 3-6 ч, дополнительно определяют частоту гибели куриных эмбрионов коэффициент прочности адгезии, абсолютное количество прочноприкрепившихся микроорганизмов и достижение максимальных значений этих показателей к концу инкубирования.

Пример 1. Изучаемой 16-часовой культурой на бульоне Хоттингера рН 7,2-7,4 в дозе 1-310 (холерные вибрионы 0,5-0,9-10 ) микр.клеток в 0,1 мл заражают 10 куриных эмбрионов 11-12-дневного срока развития. Заражение осуществляют в аллантоисн Яо полость общепринятым методом. Контролем служат эмбрионы, которым вводят стерильный бульон. Такие эмбрионы продол5лают нормально развиваться в течение нескольких суток. Гибель опытных эмбрионов начинают регистрировать через 3-4 и каждый последующий час путем просмотра их на овоскопе. О гибели судят по обездвиживанию

зародьша, истончению и запустению кровеносных сосудов. Культуры, вызывающие гибель 50% и более зараженных эмбрионов через 5-6 ч, относятся к I группе и обладают выраженной способностью к адгезии. Культуры, вызывающие гибель большей части эмбрионов через 8-24 ч (поздняя гибель) относятся к И группе и не имеют выраженных адгезивных свойств.

П р и м е 2. Каждой исследуемо (холерный вибрион, кишечная палочка) культурой заражают по 4 куриных эмбриона общепринятым способом. На каждом сроке вскрывают по 2 эмбриона. Для стерильного взятия тканей и жидкостей после инкубации скорлупу над воздушной полостью прожигают, срезают ее ножницами и разрезают подлежащие оболочки. Отсасывают аллантоисную жидкость и замеряют ее объем. Переворачивая эмбрион над стерильной посудой, с помощью ножниц и пинцетов удаляют амниотический мешок с зародышем, желточный мешок. Затем отслаивают ХАО и переносят ее на стерильную чашку Петри, удаляют белковую массу. Далее проводят последовательное промывание 2 оболочек вместе в 3-4 объемах по 100-150 мл теплого физраствора (37°). Промытые ХАО растирают в ступке с небольшш4 |количеством кварцевого песка. Гомо|генат 2 ХАО смывают 2 мл физраствора затем пипеткой переносят в мерную пробирку. Отмечают его объем, вычитая объем кварцевого песка. Для посева три первые промывные воды сливают вместе. Количественные микробиологические посевы производят общепринятым методом на агаровую пластину с пересчетом количества микроорганизмов на весь объем пробы.

. Количественные показатели, характеризующие адгезию, определяют по формуле

100%,

Т .

(в,+в)

а + t +

индекс адгезии, т.е. процент

Т прочноприкрепившихся микроорганизмов;

абсолютное количество прочt ноприкрепившихся микроорганизмов;

наменатель - сумма микроорганизвсей популяции: а - абсолютное количество микро организмов, не обладающих способностью прикрепляться (содержатся : в аллантоисной жидкости) , 7 ъ,.ь,абсолютное количество слабо прикрепившихся микроорганиз мов (смытые соответственно в трех первых и последней промывных водах). Величины А (количество микроорганизмов, неспособных к адгезии), В и Б (микроорганизмы, обладающие слабой адгезией) вычисляют аналогично индексу адгезии Т. t КПА --, показывает во сколько « раз больше осталось микроорганизмов на оболочке, чем в.последней промывной воде, т.е. характеризует степень прочности прикрепления. Применение куриных эмбрионов вместо трудоемкого метода изолированных петель тонкой кишки кролика делает предлагаемый способ широко доступным, обеспечивает стандартные условия проведения опыта. Предлагаемые критерии оценки адгезивной способности с использованием индекса адгезии еще двух показателей - КПА и количества прочноприкрепившихся возбудителей с учетом их максимальных значений через 4-5 ч - позволяют, достоверно определять способность культур к адгезии. Возможность пред.варительной качественной оценки зна чительно экономит время (в прототипе 30-36 ч, в предложенном способе 20-24 ч) и трудозатраты, так как исключает из дальнейшего количественного изучения до 18% культур (среди НАГ вибрионов и кишечных палочек значительно больше).

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АДГЕЗЙВiHMX,СВОЙСТВ МИКРООРГАНИЗМОВ, ВЫЗЫЗАКЯЦИХ КИШЕЧНЫЕ ИНФЕКЦИИ, путем :введения исследуемой культуры в жиBCfti организм с последующим определением адгезивных свойств по индексу а дгезии, отличающийся тем, что, с целью ускорения и повьшения точности способа, исследуемую культуру вводят в аллантоисную полость развивающихся куриных эмбрионов, инкубируют в течение 3-6 ч, дополнительно определяют частоту гибели куриных эмбрионов, коэффициент прочности адгезии, абсолютное количество прочноприкрепившихся микроорганизмов и достижение максимальwax значений этих показателей к кон.цу инкубирования. (Л g 00 4 Г) са