Способ количественного определения доступного лизина в белках Советский патент 1981 года по МПК G01N33/02 G01N33/00 

I

Изобретение относится к способам оценки зерна и других белковых продуктов растительного и животного . происхождения по содержанию в них доступного (усвояемого организмом ) лизина.

Известен способ количественного определения доступного лизина в белках, включающий тонкое измельчение пробы, денатурирование из нее белков и обработку белков раствором 2,4-динитрофторбензола. 01

Однако этот способ недостаточно точен, поскольку noivMi-io -аминогруппы лизина вступали во.взаимодействие с реактивом фенольные, имидозольные, гуанидиновые и сульфгидрильные остатки аминокислот.

Цель изобретения - упрощение процесса и повышение точности определения.

Поставленная цель достигается тем, что для денатурации белкОв используют водный раствор этанола 70%-ной концентрации, в качестве реактива для обработки белков используют раствор П-бензохинона, а после обработки белков реактивом, анализируемую пробу обрабатывают при 70-71 С раствором -аминокапроновой кислоты с последующим охлаждением,центрифугированием и колориметрированием. Причем используют 0,02%-иый раствор П-бензохинона в 88-95%-ном зтансше, а также 1%-ньй раствор , -аминокапроновой кислоты в 70%-ном этаноле.

Поскольку доступный лизин по предлагаемому способу определяется в белковьЕх: продуктах без гидролиза белков, следует особо подчеркнуть важность тонкого измельчения материала с тем, чтобы 80% муки проходило через сито 0,1 мм. При отсутствии

20 необходимых мельниц тонкий помол осуществляют измельчением материала в ступке с равным по весу порошком стекла. в экспериментах использовался ВХ фирмы Реахим ((чистый). Реакционная активность определялась иодоматричес ким способом. Она оказалась равной 88j9%. При более низкой активности реактив следует перекристаллизовать из спирта. Концентрация спиртового (этанолj раствора ВХ подбиралась экспериментально .на основе развиваемой окраски после добавления лнзина или -«аминокапроновой кислоты. Наиболее оптимальной оказалась концентрация ВХ, равная 0,02%. В 4 мл такого раствора содержится с учетом чистоты 712 мгк ВХ.Учитывая, что на одну молекулу лизина расходуется две молекулы ВХ, это соответствует 480 мк лизина. Теоретически при навеске белкового продукта, равной 50 мг, этого количества ВХ достаточно,чтобы определить доступный лизин при его содержании 0,8% и выше на сухое вещество. Фактически этот предел не должен превьшать 0,5-0,6%, так как в разбавленных растворах ВХ его реак ции с лизином замедляются. При определении лизина в продуктах с более высоким его содержанием ( сухое молоко, зерно-бобовые культуры, мясокостная мука и др.) концентрацию лизина в исходном материале следует понизить путем смешивания в ступке с соответствующим количеством чисто.го крахмала. Напротив, при более низких содержаниях общего лизина (0,2-0,3% } навеску материала можно увеличить до 100 мг, Раствор ВХ в этаноле при хранении в комнатной температуре, даже в ко-. ричневых склянках, постепенно желтеет . В целях предотвращения этого процесса в раствор следует добавить следовые количества азотнокислой ( окисной ртути, К 10 каплям насыщенного раствора Н (N0)rt(400-450 мг) добавляют 10 капель концентрированной азотной кислоты и доводят водой до 100 мл. К 100 мл 0,02%-ного ВХ в 88%-ном этаноле добавляют 0,3 мл рабочего раствора Нл. (NO-i) . При Jcpaнeнии в холодильнике.раствор ВХ не теряет годности в течение 2 сут, В целях использования в анализах регенерированного эталона в работе при менялся 88%-ны этанол (отгонка с 80 см дефлегматором. Этанол-ректифи кат можно заменить гидролизным этано лом высокой очистки. Концентрация 4 ,4 спирта ниже 75% повышает чувствительность реактива к другим аминокис-i лотам. В качестве контроля можно применять как раствор (ОСНОВНОГО лизина, так и раствор -аминокапроновой кислоты в 70%-ном спирте. Однако наличие у свободного лизина второй NH -rpynпы усиливает его нуклеофильность, вследствие чего реакция взаимодействия с ВХ ускоряется и при больших концентрациях лизина и заканчивается через 10-15 мин, в то время как для. завершения реакции ВХ с f -аминокапроновой кислотой при тех же условиях требуется 20-30 мин. Поскольку остаток молекулы лизина,связанного в белках, по количеству СИ2 и МНоГРУПп соответствует ЕАК кислоте, последняя является более предпочтительным реактивом в качестве контроля и стандарта для калибровочной кривой. 1 Недостатком фирменного препарата ЕАК кислоты является присутствие некоторого количества лактамной ( циклической формы, которая не взаимодействует с ВХ. Поэтому расчет концентрации раствора ЕАК кислоты для калибровочной кривой производился не на основе стехиометрического соотноше1ЫЯ, а путем подгонки оптической плотности раствора ЕАК кислоты к оптической плотности раствора лизина. Изучение реакции ВХ со свободными аминокислотами показало,что из общего числа нейтральных и кислых аминокислот только глицин и пролин развивают слабую окраску с раствором ВХ ( 0,Cf30,04 экстинкции приконцентрации 1 мм) однако содержание этих аминокислот в свободном .виде в измельченном зерне весьма незначительно, а глицин и пролин, связанные в белках, не всту-. пают в реакцию с ВХ, Что касается аргинина и гистидина, то их присутствие в анализируемом материале несколько повьш1ает экстинкцию и составляет до 1/3 суммы экстинкции свободных лизин-apгинин-fИcтидин,Oднaкo есть основания считать, что будучи связанным в белках, ойи также не реагируют с ВХ, что подтверладается отсутствием их взаимодействия при анализе зерна кукурузы. Эти же данные, указьшают на отсутствие реакции ВХ с концевыми аминогруппами белков.