Способ количественного определения антипирина в крови Советский патент 1982 года по МПК G01N33/50 

Изобретение относится к аналитической химии и может быть использова но в медицине, фармакологии и биохимии. Антипириновый тест предложен для количественного определения влияния различных факторов на способность печени метаболизировать лекарства. Известен спектрофотометрический способ определения антипирина в крови. Антипирин экстрагируют из крови хлороформом, затем его упаривают и о таток растворяют в разбавленной сер ной кислоте. К раствору прибавляют нитрит натрия, измеряют величину оптической плотности образовавшегося -нитрозоантипирина при 350 нм. К центрацию антипирина определяют по градуировочному графику f j. Однако для известного метода определения необходимо от 1 до 5 МП крови на каждый из 6-10 образцов, испопьзуемых при проведении фармококинетических исследований. При этом анализ каждого образца занимает не менее часа. К недостаткам метода следует также отнести использование токсичного хлороформа. Цепью изобретения является сокращение объема исследуемого образца и времени определения. Поставленная цель достигается тем, что образцы гемолизированной крови вводят в реакцию окисления дифенилкарбазона перекисью водорода, после чего измеряют оптическую плотность пробы с интервалами во времени, а по изменению оптической плотности определяют антипирин в пробе. Приме р.А. Построение градуировочного графика. У обследуемого до приема антипирина отбирают из пальца в микропробирку с 5 мкл гепарина примерно 0,13 мл крови. Кровь подвергают гемолизу, помещая пробу на 30 мин в холодильник (5С ) с последую1цим размораживанием. В четыре микропробирки 3з наливают по 30 мкл гемолизированной крови. Первую пробирку используют ка нулевую пробу, во вторую - четвертую пробирки прибавляют по 3 мкл водного раствора антипирина с концентрацией 100 мкг/мл, 300 мкг/мл и 500 мкг/мп антипирина соответственно. образом, получают четыре образца, необходимые для построения градуировочного графика, с концентрациями aнtипиpинa во второй четвертой пробирках соответственно 10 икг/мл, 30 мкг/мл и 50 мкг/мл. Эт знамения концентраций градуировочног графика находятся в предела) концент раций антипирина, наблюдаемых в крови обследуемых в течение 24 ч после приема 1 г антипирина. Далее проводят реакцию окисления / фенилкарбазона перекисью водорода в кварцевом смесителе с 3-мя отростка. 8 1-ый отросток смесителя вводят 0,5 мл раствора дифенилкарбазона, во 2-й - 1 мл раствора перекиси водорода, в 3-ий - 10 мкл крови из нулевого образца микропипеткой на to мкл. Промывают пипеткУ в тот же отросток смесителя 10 мкл боратного буферного раствора. Затем буферным раствором доводят общий объем в смесителе до 10 мл. Смеситель переворачивают, одновременно .включая секундомер. Энергично встряхивают. Через 3-Ю с пере ливают раствор в кювету (длиной 3 см Заданная Значение оптической пл ности в фиксированные концентрация антипирина моменты времени, с (для градуировочного графика, мкг/мл

10

30

50

Т а б

лица 1

21,65

26,15

31,90 4 и на пятом светофильтре (tSO+IO нм) ФЭК-56М измеряют значение оптической плотности через 20,30 и kS с, после смешения. Каждый раз после проведения измерений смеситель и кювету многократно промывают бидистиллированной водой. Аналогично проводят реакцию с участием всех остальных образцов крови (концентрации антипирина 10,30 и 50 мкг/л). Измерение каждой пробы осуществляют дважды. На основании измеренных величин оптической плотности растворов, полученных через 20,30 и kS с после смешения растворов, строят прямую в координатах оптическая плостность время и определяют изменение оптической плотности дА за единицу времени дt или, что то же самое, тангенс угла наклона прямой (tg ct) . В табл.1 приведены значения tgol, приведенные к t мин 60 с), как обычно принято в кинетических методах анализа, а также средние значения tgcL, полученные по результатам двух измерений. Градуировочный график строят, откладывая по оси ординат средние значения tgcL, а по оси абсцисс .- соответствующие известные концентрации антипирина в крови. В табл.1 приведены данные для определения содержания антипирина в крови. Изменение Средней оптической зрачение плотности мин Ю

Значение оптической плотности в фиксированные моменты времени, с

воч20 ,

0,920 0,8700,760

0,950 0,875

Среднее

Изменение оптической значение 10 плотности мин 10

5

38,05

37,7

0,800

36,0

Аналогично указанному проводят измерения tgd для неизвестных концентраций антипирина (табл.1) и по градуировочному графику находят соответствующие значения концентраций антипирина.

Полученные по градуировочному графику величины концентраций антипирина у двух обследуемых приведены в табл.2.

Для проверки правильности метода все образцы крови исследовали на содержание антипирина одновременно спектрофотометрическим методом.

В табл.3 приведены результаты определения антипирина кинетичес КИМ и спектрофотометрическим методами

В. Определение концентрации антипирина в крови.

Обследуекый принимает 1 г антипирина. Через 1 и 2 ч после приема препарата у него из пальца отбирают кровь в микропробирки по 30 мкл, в которые предварительно введено по 5 мкл гепарина. Пробы до анализа хранятся 8 холодильнике ().

Таблица 2

Введено в венозную кровь (модельная система)

Как видно ИЗтабл.2 и 3, обоими методами получены близкие значения концентрации антипирина.

По сравнению со спектрофотометричаским методом кинети.ческий метод анализа антипирина имеет ряд преимуществ .

В течение суток у обследуемого должно быть отобрано 6-10 образцов крови через определенные промежутки времени. При использовании спектрофотометримеского метода необходимо 50 мл крови, что требует отбора крови из вены. Это связано с необходимостью введения в вену катетера на весь период исследования, что весьма нежелательно. Для кинетического метода достаточно крови, взятой из . Предлагаемый метод значительно сокращает время анализа. При использовании спектрофотометрического метода на анализ одного образца затрачивается 1 ч, а кинетичес вэго - 1 мин.

Кинетический метод прост и доступен. Для его осуществления требуется только смеситель и фотоэлектроТаблица 3

39 +

0

5+6

колориметр, тогда как для спектрофотометрического метода необходима дополнительно разнообразная специальная посуда для проведения предварительной экстракции.

Формула изобретения

Способ определения количества антипирина в крови, включающий подготовку образца крови, с последующим измерением его оптической плотности, отличающийся тем, что, с целью сокроцения объема исследуемого образца и времени определения, обработку образца крови про водят путем гемолиза с последующим

введением его в реакцию окисления дифе1 1лкзрбазона перекисью водорода, после чего измеряют оптическую плотность пробы с интервалами во времени, а по .изменению оптической плотности определяют антипирин в пробе.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. Г Biol Chen 179, № 1, 25 (19