Способ определения инсулина Советский патент 1983 года по МПК G01N21/78 

о 4

Изобретение относится к аналитиМеской химии, а именно к способам Ьпределения лекарственного препарата - инсулина.

Известен способ определения инсу лина путем обработки анализируемого вещества сначала раствором нингидрина в метилцеллозопьве в присутствии цитратного буферного раствора, затеи раствором цианида калия при нагревании до 100 С с последующим добавлением к полученному раствору этилового спирта и его фотометрированием . Недостаток данного способа состои1 в его сложности, связанной с многостадийноетыо.

Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемым результатам является способ определения инсулина путем обработки раствора анализируемого вещества щелочью и сульфатом меди с последующим измерением оптической плотности полученного окрашенного соединения Е2 .

Недостатком известного способа является его низкая чувствительность (0,5 г )и неселективность, связаннаяс тем, что определению мешают все белки и полипептиды.

Цель изобретения состоит в повышении чувствительности и селективности способа.

Поставленная цель достигает Ся тем, что согласно способу определения инсулина, вводят пробу анализируемого вещества в раствор, содержащий гидрохинон и сульфат меди, к полученной смеси добавляют боратный буферный раствор и перекись водорода с последующим измерением изменения оптической плотности полученного раствора.

Способ определения инсулина в лекарственных препаратах осуществляют следующим образом.

Вводят аликвоты стандартного раствора 8 реакцию окисления гидрохинона перекисью водорода, катализируемую ионами Си. Определяют скорость этой реакции по изменению оптической плотности во времени, выражая ее как тангенс угла наклона прямой в координатах оптическая плотность - время CtgoL). Используя полученные величит ны (tqJdl}для различных аликвот стандартного раствора строят градуировочный график в координатах тангенс угла наклона - концентрация инсулина, по которому определяют содержание инсулина в исследуемых образцах. При определении содержания инсулина в образцах лекарственных препаратов для перорального, в частности, сублингвапьного применения, необходимо при построении градуировочного графика вводить в реакционную смесь аликвоту водного раствора плацебо, равную аликвоте водного раствора исследуемого образца. Время, затрачиваемое на анализ одного об.разца составляет 5 мин. Метод позволяет определить не биологический эффект от введения инсулина, а его количественное содержание в водных растворах лекарствен.ных форм.

Пример . Определение содержания инсулина в образце препарата для перорального применения. По своем составу препарат J содержащий инсулин, и плацебо идентичны, за исключением активного вещества. В качестве стандарта используют коммерческий препарат (0 и.е./мл.

А. Построение градуировочного графика.

В спектрофотометрическую кювету {6 2 см ) вводят 0,7 мл водного раствора гидрохинона (0,2); 1,0 мл водного раствора CuS04 1,0 мл водного раствора плацебо (Гпластинка в 25 мл); боратный буферный раствор (рН 7,8). до общего объема 1.0 мл, (. )мл стандартного раствора инсулина (40 л.е./. /1 мл}; 0,3 мл концентрированной i. НjO. В момент введения НдО включа ют секундомер и измеряют значение оптической плотности на ФЭК-ЗбМ (Ф № 5) через каждый 15 g от 30 до 120 с. Каждый раз после проведения измерений кювету многократно промывают бидистиллированной водой. Данные для определения содержания инсулина в образцу препарата для перораяьного применения даны в табл. 1. s 103070 4

О О, 0,8

Значения оптической плотности (п 3)

1,6

Исследуемый образец 6 Продолжение табл. 1

Среднее

ОНО

0,25

На основании измерений велим|ин оптической плотности растворов строят прямую в координатах оптическая плотность - время и определяют иэиенеиие оптической плотностидА за единицу времени at или, что тоже самое, тангенс угла наклона прямой tgo В табл. 1 приведены значения tgoC, приведенные в 1 мин (ЛТ:: 60 с), как обычно принято в кинетических методах анализа, а также средние значения tgd, полученные по результатам трех измерений. Градуировочный график строят, откладывая по оси ординат значения tgc а по оси абцисссоответствующие известные концентрации инсулина.

Уравнение градуировочной прямой

tgoi-x 10 7,,16 Сине.

Предел обнаружения - 0,26 и.е/ /10 мл, что соответствует 6,5 и.е./ /пл.

0,16

0,22

0,05

О.+О

0,55

0,13

В спектрофотометрическую кювету (2 2 см вводят 0,7 мл водного раствора гидрохинона 0,2% ; 1,0 мл водного раствора CuS04 ()

1,0 мл водного раствора исследуемого образца (1 пластинка в 25 боратный буферный раствор (рН 7,-8) до общего объема 10 мл; 0,3 мл концентрированной Н202 В момент введения включают секундомер и измеряют значения оптической плотности (табл. 1). Рассчитывают занчения ( определяют содержание инсулина в образце по полученному ранее градуированному рафику Су, 12,5 и.е,/ /пл.

П р и м е р 2 . Определение содержания инсулина в коммерческом препарате для инъекций с содержанием инсулина 40 и.е./мл. В качестве стандарта использован кристаллический инсулин (25,2 и.е.).

А. Построение градуировочного

5 графика.

.8 спектрофотометрическую кювету (2 2 см вводят 0,7 мл воднрго раствора гидрохинона (0, мл

7ЮЗОУС 8

водного раствора CuSO (); лина (5 и.е./мл), 0,3 мл концентриборатный буферный раствор (рН 7,8) рованной HgO. Далее поступают, как до объема 10 мл (O-IOO)wA описано в примере (f 1 .Значение оптичесстандартного водного раствора инсу- кой плотности и X приведены в табл.2.

11

Уравнение градуировочной прямой fg.oL X 10 6,7-3,8 Сине.

Предел обнаружения - 0,1 и.е./ /.10 мл.

Б. Определение инсулина в образц коммерческого Препарата для инъекций. .

В спектрофотометрическую кювету ( см) вводят 0,7 мл водного раствора гидрохинона (Q,2%); 0,2 мл водного раствора CuSO (6-10 М); 70 мл водного раствора исследуемого Ьбразца инсулина, разбавленного в 10 раз, боратный буферный раствор (рН ) до общего объема 10 мл;

0,3 мл концентрированной N202- В момент введения Н-О включают секундомер и измеряют значение оптической плотности на ФЭК-56М через каждые 5 15 с от 30 до 120 с. В табл. 2 представлены данные для определения содержания инсулина в коммерческом препарате для инъекций.

Далее поступают, как описано в 10 примере 1. Содержание инсулина определяют по градуировочному графику С А и.е./1 мл исследуемого раствора (О, 31 и.е./10 мл).

15 Предлагаемый способ позволяет повысить чувствительность способа и его ; селективность.