1
Изобретение относится к медицине, а именно к нефрологии для диагностики сглицерофосфолипидеиий при гломерулонефрите и хроническом пиелонефрите.
Известен способ диагностики диффузного гломерулонефрита путем определения в сыворотке крови пациента хроматографических фракций фосфатидилсерина, фосфатидилхолина, фосфатидилэтаноламина, фосфаТидной кислоты , определения содержания в них липидного фосфора с последующим сравнением его количества в каждой фракции с таковой полученной из сыворотки здорового человека 1 .
Однако известный способ не обеспечивает необходимой точности диагностики диффузного гломерулонефрита.
Цель изобретения - повышение точности способа.
Поставленная цель достигается тем, что при осуществлении способа диагностики диффузного гломерулонефрита путём определения в сыворотке крови пациента хроматографических фракций фосфатидилсерина, фосфатидилхоли на ч фосфа тидилэ та н олани на,фосфатидной кислоты, определения содержания в них липидного фосфора с последующим сравнением его количества в каждой фракции с таковой, полученной из сыворотки здорового человека, дополнительно выделяют фракцию сфингомиелина и определяют в ней содержание липидного фосфора.
СпосЬб осуществляют следующим образом.
К сыворотке крови 1,О мл добавляют 10,0 мл смеси хлороформ-метанола (объемная пропорция 2:1). Содержание пробирок перемешивают и выдерживают на водяной бане 3040 мин при 40-45°С. Этим достигают выделение липидов из липопротеиновых комплексов и осаждение денатурированного белка. Содержание пробирок фильтруют через складчатый
фильтр в дрозофильные стаканчики. Для удаления из экстракта водорастворимого фосфора на фильтрат наслаивают 15-20 объемов дистиллированной воды. Ее добавляют до верха стаканчика и ставят в сосуд также с дистиллированной водой на ночь. На следующий день верхнюю водную фазу осторожно удаляют с помощью водоструйного насоса, а к нижней (хлороформенной фазе, содержащей липиды) добавляют по каплям метанол (1-2 мл) до полного растворения тонкого пограничного слоя-пленки. Затем производят выпаривание в термостате при 5055°С. После выпаривания липиды растворяют в 0,5 мл смеси хлороформ-метанола (2:1) и наносят шприцем на пластинки с тонким слоем силикагеля (марки КСК), который предварительно измельчают на шаровой мельнице, отмучивают и отмывают от примесей железа. Используют частицы размером 200 меш. .Размер пластинок 13x18 см. Силикагель тщательно перемешивают с водой и полученную однородную массу наносят на пластинку, находящуюся на столике со строго горизонтальной поверхностью. Непосредственно перед нанесением липидов пластинки с силикагелем активируют в термостате при в течение 50 мин. Перед нанесением вещества пластинку с адсорбентом выдерживают в камере для насыщения силикагеля аммиаком до тех пор, пока фронт растворителя не достигнет верх него края пластинки. Липиды наносят полоской шириной мм на расстоянии 1,5 см от нижнего края пластинки. Разгонку производят в камере с системой растворителей хлоpoфopм-мeтaнoл-7N №1з(60:35:5) в течение мин. При этом хлороформ и метанол после соответствующей обработки (хлороформ после высушивания над СаСЕ2 и метиловый спирт после абсолютирования) перегоняют. Хроматографировагь повторно в одной и той же порции растворителей не рекомендуется. Растворитель заливают в камеры за 1 ч до погружения в них пластинок. Для лучшего насыщения стенки камерьк с внутренней стороны до дна покрывают фильтровальной бумагой. Оптимальная температура для разделения фосфолипидов 22 С ПРИ более низких температурах растворитель проходит через пластинку очень медленно, при более высоких получается нечеткое деление. После разделения хроматограмму- вынимают
из камеры и сушат в термостате при а течение мин. Для проявления фосфолипидов используют пары йода. Йод окрашивает липиды, имеющие ненасыщенные связи, в темнокоричневый цвет. Насыщенные липиды слабо окрашиваются парами йода. Окрашенные пятна обводят препаровальной иглой. Для идентификации фосфолипидов используют характерные цветные реакции и изменение величин В - отношение расстояния от старта до середины идентифицируемого пятна к расстоянию от старта до фронта. 8 качестве специфических проявителей применяют раствор нингидрина, аммиачный раствор азотнокислого серебра, реактив Драгендорфа и родамин 6У. Применение цветных реакций и величины Rf
ПОЗВОЛЯЮТ идентифицировать 5 фракций: фосфатидилсерин, сфйнгомиелин, фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидную кислоту. Перед определением фосфолипидов строят калибровочную кривую по стандартному раствору KHjPO. Далее каждую фракцию переносят в пробирки для сжигания, куда добавляют по 1 мл . Сжигание длится мин.
После этого добавляют в пробирки по 1 мл воды и переносят в центрифужные пробирки. Время центрифугирования 10 мин при 3000 обУмин.Процедуру повторяют дважды, k центрифугату добавляют по 0,2 мл молибдата аммония и 0,2 мл эйконогена. Содержание пробирок перемешивают и доводят водой до 5 мл. В качестве контроля берут силикагель
из тех зон .хроматограмм, где не обнаружено наличие фосфолипидов, и проводят все операции, как и для проб. Фотометрию осуществляют на СФ- при длине волны 830 нм. Расхождение в определений глицерофосфйлипидов в параллельных пробах не превышает в среднем 5%, что свидетельствует о хорошей воспроизводимости, метода . Результаты выражают в микрограммах липидного фосфора, а окончательно в процентах.
Пример 1. Больная Р-ва Е.Г., ffl год, диагноз: острый диффузный гломерулонефрит с изолированным мочевым.синдромом; Хроматограмма фосфолипидов: фосфатидилсерин (ФС) 12,6, сфингомиелин (СФ) 16,7%, фосфатидилхолин (ФХ) 56,7%, фосфатидилэтаноламин (ФЭА) 10;8%, фосфатидная. кислота (ФК) 3,2%.
Пример 2. Больной 0-н Н.В., 37 лет, диагноз: острый диффузный гломерулонефрит с нефротическим синдромом. Нефрогенный отек легких. Остаточные явления рожистого воспаления в области голеней. Хромдтограмма фосфолипидов: ФС 8,8%, СФ 13,5%, ФХ 56,3%, ФЭА 17,5%, ФК 3,5%.
Пример 3. Больной П-в В.Ф., 8 лет, диагноз: хронический диффузный гломерулонефрит с изолированным мочевым синдромом. Сопутствующие заболевания: хронический бронхит. Эмфизема легких, дыхательная недостаточность. Хроматограмма фосфолипидов: ФС 11,3%, СФ 22,7%,ФХ 50,7% ФЭА ,5%.
Пример . Больной П-нь В.Ф. 49 лет, диагноз: хронический диффузный гломерулонефрит с гипертензивным синдромом. Сопутствующие заболевания: пневмофиброз. Хроматограмма фосфолипидов: ФС 1,4%, СФ 19,9%, ФХ ,1%, ФЭА 13,2%, ФК 3,%.
Пример 5. Больной Б-в,Ю.П. лет, диагноз: хронический диффузный гломерулонефрит смешанного типа, фосфолипидограмма: ФС 12,7%, СФ 12,4%, ФХ 45,3%, ФЭ,А 19,9%, ФК 9,7%.
Пример 6. Больной П-в Б.А., 43 лет, диагноз: хронический диффузный гломерулонефрит в терминальной стадии. Фосфолипидограмма: ФС 10,7%, СФ 28,2%, ФХ 45,9%, ФЭА 11,6%, ФК 3,6%.
Пример 7. Больная В-ва И.П., 47 лет, диагноз: хронический пиелонефрит без нарушения азотовыделительной функции почек преимущественно с поражением одной почки.Сопутствующие заболевания: гипертони ческая болезнь II ст., церебро-кардиальный вариант. Диффузный эутиреоидный зоб. фосфолипидограмма: ФС 15,6%, СФ 17,3%, ФХ 30,1%, ФЭА 23,7%, ФК 13,3%.
Пример 8. Больная 3-ва О.А. 54 лет, диагноз: хронический пиелонефрит без нарушения азотовыделительной функции почек с преимущественным поражением обеих почек. Фосфолипидограмма: ФС 14,7%, СФ 19,2%, ФХ 31,4%, ФЭА 22,1%, ФК 12,6%.
Предлагаемый способ был применен при обследовании 123 больных в возрасте от 11 до 73 лет. Наблюдением установлено, что повышение одной фракции ФХ от 44,0 до 61,0% и уменьшение трех фракций: ФС от 17,1 до 6,3%, ФЭА от 22,0 до 4,4%, ФК от 10,8 до 0,6% свидетельствует об остром диффузном гломерулонефрите; отличие от нормы пяти фракций - повышение двух фракций: СФ от 14,7 до 23,9%, ФХ от 33,6 до 63,7% при понижении трех фракций: ФС от 15,5 до 8,3%, ФЭА от 25,7 до 4,0%, ФК от 8,3 до 1,8% - подтверждает диагноз хронического диффузного гломеру лонефрита с-изолированным мочевым и нефротическим синдромом; отличие от нормы трех фракций - повышение одной фракции ФХ от 31,8 до 59,8% и понижение двух фракций: ФЭА от 22,8 до 8,4%, ФК от 11,1 до 2,1% - свидетельствует о хроническом диффузном гломерулонефрите с гипертензивным синдромом;отличие двух фракций от нормы - повышение одной фракции ФХ от 25,9 до 61,9% и понижение одной фракции ФС от 17,1% до 7,1% - говорит о наличии хнического диффузного гломерулонефрита смешанного типа; отличие от нормы одной фракции - понижение ФС от 13,8 до 5,4% - подтверждает диагноз хронического диффузного гломерулонефрита в терминальной стадии.
Таким образом, предлагаемый способ позволяет получить пять фракций и выгодно отличается от известного способа, тем, что фракции сфингомиелина и фосфатидилсерина совершенно четко делятся и, таким образом, исключаются погрешности при определении липидного фосфора в них, что увеличивает возможность более точной диагностики диффузного гломерулонефрита.
Формула изобретения
Способ диагностики диффузного .гломерулонефрита путем определения в сыворотке крови пациента хроматографических фракций фосфатидилсери732kS728
на, фосфатидилхолима, фосфатидил-ределяют в ней содержание липидного
этаноламина, фосфатидной кислоты,фосфора определения содержания в них липидного фосфора с последующим сравне- , Источники информации,
нием его количества в каждой фрак- sпринятые во внимание при экспертизе ции с таковой, полученной из сыворот- 1. Смирнова Н.Н. Изменения содерки здорового человека, отличаю-жания глицерофосфолипидов при дифщ и и с я тем, что, с це/5ью повыше-фузном гломерулонефрите у детей,
ния точности способа, дополнительноАвтореф, дис. на соиск. учен, степевыделяют фракцию сфингомиелина и оп- 10ни канд. мед. наук. Л., 197.
