Способ определения активности малатдегидрогеназы в биологических тканях Советский патент 1982 года по МПК G01N33/48 

(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ МАЛАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ТКАНЯХ

Изобретение относится к медицине, а именно к способам изучения энергетического обмена в тканях животных и человека.

Известен способ определения малатдегидрогенаэы в биологических тканях, включеиощий инкубацию гомогената исследуемой ткани в буферном растворе с субстратом, внесение в инкубационную смесь кофермента и спектрофотометрию полученной смеси l.

Однако известный способ имеет недостаточную чувствительность и неспецифичен, вследствие того, что запуск реакции -коферментом приводит к активации многих других НАДФ-зависшлых дегидрогеназ .

Цель изобретения - повышение чувствительности и специфичности спосо ба.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определения малатдегидрогеназы в биологических тканях, включающего инкубацию гомогената исследуемой ткани в буферном растворе с субстратом, внесение в инкубационную смесь кофермента и спектрофотометрию полученной смеси, кофермент вносят непосредственно в раствор гомогената, выдерживают в тече.1|ие

5-60 мин в физиологическом режиме, далее добавляют субстрат.

Способ осуществляется следующим образом.

После забора ткани хранят и гомогенизируют на холоду в 0,05м трисбуфере в соотношении 1:20. Инкубационная смесь состоит, мл: 0,05М трис-буфер ,4 2,5; МпСЁ 0,03м-0,1;

10 НАДФ 0,1 (3 мг в мл), гомогенат 0,2.

Общий объем 3 МП. Предварительную инкубацию проб -с (после встряхивания) проводят в течение 5-60 мин при 37°С. Реакцию запускают добавление 0,ЗЗМ субстрата 0,25 натрия яблочнокислого. Активность определяют по разности экстинкции на первой-тридцатой-шести20десятой минуте и выражают в наномолях на 1 г ткани за 1 ч.

П.р и м е р 1. Печень гомогенизируют на холоду в 0,05М трис-буфере

25 в соотношении 1:20. Затем проводят преинкубацию при 37 С в течение 5 мин в инкубационной смеси следующего состава, мл: 0,05М трис-буфер рн 7,4-2,5; 0,ОЗМ ,; НАДФН (3 мг

30 в мл) 0,1; гомогенат 0,2. ./

Общий объем пробы - 3 мп.

Реакцию запускают добавлением 0,33 мл субстрата натрия яблочного 0,25 мл. Активность определяют по разности экстинкций на 0-30-60 мин и выражают в наномолях на 1 г ткани за 1 ч. Подсчет активности фермента .проводился по следующей фор:Муле: Д --;j , - разность

экстенкций, 3 - объем кюветы, к коэффициент молярной экстинции НАДФН п г разведение ткани.

Пример 2. ДеснзчИ слюнные железы (околоушная и прлчелюстная) гомогенизируют на холоДу в 0,05М трис-буфере в соотнсжаении 1:20. Затем проводят преинкубацию при 37°С в течение 30 мин в инкубационной смеси. Состав смеси и остальное ансшогично прицеру 1. Активность малой дегидрогеназы в этих тканях 50 и 25-45 нмоль/г/ч.

Пример 3, Выделенные гшьвеолярный отросток и ребро гомогенизируют на холоду в 0,05м трисбуфере в соотношении 1:20. Затем проводят преинкубацию при в течение 60 мин в инкубационной смеси. Состав смеси и остальное аналогично примеру 1. Активность малатдегидрогеназы - 5,5 и 55 нмоль/г/ч. Предлагаемый способ обладает высокой чувствительностью, и специфичностью, что позволяет применять его для определения активности малатдегидрогеназы во всех тканях.

Формула изоб1 етения

Способ определения малатдегидро-.

геназы в биологических тканях, включающий инкубацию гомогената исследуемой ткани в буферном растворе с субстратом, внесение в инкубационную смесь кофермента и спектрофотометрию полученной смеси, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности и специфичности способа, кофермент вносят непосредственно в раствор гомогената,

выдерживают в течение 5-60 мин в физиологическом режиме, далее добавляют субстрат.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

.1. Степанова Н.Г. НАДФ-ферменты в нормальной сердечной мышце и при экспериментальном миокардите, Вопросы мед.хим., 1969. 15, с. 346-351.