Способ определения активности глютатион-пероксидазы в биологических тканях Советский патент 1982 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к.медицине. а именно к биохимии, при изучении липидного обмена в тканях экспериментальных животных и человека. вестен способ определения активности глготатион-пероксидтзы в биологи ческих тканях путем инкубации гомогената ткани с гидроперекисью трет-бутила в качестве субстрата с последующим центрифугированием и спекТрофотометрией супернатанта СП. Однако известный способ не обеспечивает необходимой чувствительности из-за недостаточной специфичности и сложности известного способа. Цель изобретения - повышение чувст вительности способа. Эта цель достигается тем, что, согласно способу определения активности глютатион-пероксидазы в биологи ческих тканях путем инкубации гомогената ткани с гидроперекисью трет-бутила в качестве-субстрата с последующим центрифугированием и спектрофотометрией супернатанта, перед добавлением к исследуемой смеси субстрата инкубационную смесь выдерживают в течение 50-60 мин, а определение активнести глютатион-пероксидазы ведут на спектрофотометре при длине волны 262 нм. . Способ осуществляют следующим образом. После забора биологические ткани хранят и гомогенизируют в 0,05М фосфатном буфере в соотношении 1:50. Инкубационная смесь включает 0,3 М фосфатный буфер рН 7, - 1)2 мл; 0,05 М ЭДТА - 0,2 мл, 0,01 М глютатион восстановленный - 0,3 мл; гомогенат 0,2 мл. Предварительную инкубацию проводят в течение 50-60 мин при 37 С. Реакцию запускают добавлением 0,1 мл гидроперекиси трет-бутила 0,002 М, через 1-2 мин реакцию остаг навливают 10%-ным раствором трихлоруксусной кислоты в количестве 1 мл на пробу. В контрольную пробу гидроперекись трет-бутила не добавляют. Пробы центрифугируют в течение 15 20 мин при Т500 - 2000 об/мин, после чего отбирают по 2,5 мл центрифугата и определяют экстинкцию по разнице экстинкций между опытными и контрольными пробами при 2б5 нм.

П р и м е р 1. Околоушную железу гомогенизируют на,холоду в 0,ЗМ фосфатном буфере в соотношении 1:50. , Затем проводят преинкубацию при 37С в течение 50 мин в инкубациойной смеси следующего состава: 0,3 М фосфатный буфер рН 7, - 1,2 мл; 0,005 М ЭДТА - 0,2 мл 0,01 М глютатион вое-становленный - 0,3 мл; гомогенат 0,2 мл. Общий объем пробы 1,9 мл. Реакцию запускают добавлением субстрата - 0,002 М гидроперекиси третбутила - 0,1 мл. Через 1 мин реакцию останавливают раствором трихлоруксусной кислоты в количестве 1 мл. Контрольная проба содержит 0,3 М фосфатный( буфер рН 0,005 МЭДТА - 0,2 кл; 0,01 М глютатион восстановленный -0,3мл;гомогенат0,2 мл; трихлоруксусная кислота 1 мл. Все пробы центрифугируют и опр ределяют активность, фермента по разнице экстинкций на спектрофотометре при 2б2 нм. Выражают активность фермента в микромолях на грамм ткани в минуту и рассчитывают по формуле;

А

где && 4т - 0,2 0,02 t

разница экстинкций между контрольной и опытной пробами; 3 - объем кюветы; с.Ф -экстинкция 0,3 мл 0,01 М окисленного глютатиона,- t - время инкубации, мин. Так активность фермента в околоушной железе в среднем составляет 80б микромолеи на грамм ткани в минуту,

П р и м е р 2. Десну и альвеолярный отросток гомогенизируют на холоДУ в 0,3. И фосфатном буфере в соотношении 1:50. Затем проводят преинкубацию при 37С в течение 60 мин в инкубационной смеси (состав смеси тот же, что и а примере 1). Реакцию запускают добавлением субстрата 0,002 М гидроперекиси трет-бутила. 0,1 мл. Останавливают реакцию через 2 мин 101-ным раствором трихлоруксусной кислоты в количестве 1 мл. Остальное, как в примере 1. Активность глютатион-пероксидазы в этих тканях 198 и 180 микромолей на грамм ткани (В минуту соответственно.

Таким образом, предложенный способ позволяет повысить чувствительность методики определения активности глютатион-пероксидазы и ее специфичность, ускорить проведение исследования, повысить точность и определить активность фермента во всех тканях.

Формула изобретения

Способ определения активности глютатион-пероксидазы в биологических тканях путем инкубации гомогената ткани с гидроперекисью трет-бутилаг в качестве субстрата с последующим центрифугированием и спектрофотомеррией супернатанта, отличающ и и с я тем, что, с целью повышени чувствительности способа, перед добавлением к исследуемой смеси субстрата инкубационную смесь выдерживают в течение 50-60 мин, а определение активности глютатион-пероксидазы ведут на спектрофотометре при длине волны 2б2 нм.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Ланкин В. 3., Гуревйч С. М., Котельцева Н. В., Тихадзе А. К. и Герасимова Е. Н. Роль перекисей липидов в патогенезе атеросклероза Вопросы медицинской химии, 1976, №22, 3, с. 392-395.