СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РЕЦИДИВОВ У БОЛЬНЫХ ОСТРЫМ ЛЕЙКОЗОМ Российский патент 2013 года по МПК G01N33/50 

Изобретение относится к медицине, а именно к гематологии и онкологии, и может быть использовано при диагностике больных острыми лейкозами.

Острые лейкозы занимают одно из первых мест по частоте встречаемости среди гемобластозов. В большинстве случаев конкретная причина возникновения заболевания неизвестна. Однако болезнь неуклонно прогрессирует, и достигнутая ранее ремиссия переходит в рецидив. Появление рецидива свидетельствует о том, что опухолевый клон видоизменился и стал более злокачественным. Появление повторных рецидивов значительно ухудшает качество жизни больных и влияет, в конечном итоге, на исход заболевания в целом.

Известен способ прогнозирования рецидивов у больных острыми лейкозами по индексу ингибирования сыворотки крови больного острым лейкозом в реакции гемагглютинации с эритроцитами барана и стандартной кроличьей гемолитической сывороткой. При значении индекса ингибирования, равном или более 1,1, прогнозируют низкую эффективность лечения и высокую вероятность развития раннего рецидива [1]. Известный способ является недостаточно точным, длительным, трудоемким и имеет низкую чувствительность метода.

Задачей изобретения является создание информативного способа прогнозирования рецидивов у больных острым лейкозом.

Задача достигается тем, что в лимфоцитах периферической крови больных острым лейкозом определяют активность двух дегидрогеназ - глицерол-3-фосфатдегидрогеназы (Г3ФДГ) и НАДФ-зависимой декарбоксилирующей малатдегидрогеназы (НАДФМДГ). При сочетании активности Г3ФДГ в пределах от 0 до 0,02 мкЕ и активности НАДФМДГ в пределах от 0,25 до 6,21 мкЕ прогнозируют возникновение рецидива у больных острым лейкозом.

Пороговые интервалы значений активностей Г3ФДГ и НАДФМДГ получены опытным путем на основании сопоставления значений активностей исследуемых дегидрогеназ и данных по развитию рецидивов у больных острым лейкозом, полученных при последующем наблюдении за клиническим состоянием больных в стадии первичной атаки и полной ремиссии. У больных острым лейкозом, независимо от вида в стадии первичной атаки показатели активности дегидрогеназ варьировали: Г3ФДГ - в пределах от 0,02 до 0,88 мкЕ, а НАДФМДГ - в пределах от 6,21 до 20,87 мкЕ, в стадии полной ремиссии: Г3ФДГ - в пределах от 0,06 до 2,37 мкЕ, а НАДФМДГ - в пределах от 6,21 до 22,23 мкЕ. Рецидивы диагностировались при появлении в показателях миелограммы больных более 25% бластов после достигнутой ремиссии.

Появление острого лейкоза - сложный комплексный процесс, отражающий этапы взаимодействия организма с опухолью. Клетками, играющими важную роль в иммунологическом противоопухолевом надзоре, являются лимфоциты, следовательно, изменения в метаболизме данных клеток ведут к нарушению их функции и к несостоятельности противоопухолевой защиты организма в целом. Поэтому и ранние нарушения следует искать на уровне метаболизма самой клетки, где и начинает формироваться первая реакция на опухоль. Следовательно, дегидрогеназы, являющиеся ферментами внутриклеточного метаболизма, наиболее полно отражают изменения, происходящие в клетках. Это позволяет использовать их в качестве маркеров при прогрессировании заболевания и появлении рецидивов.

Глицерол-3-фосфатдегидрогеназа (Г3ФДГ) характеризует интенсивность переноса продуктов липидного катаболизма на окислительно-восстановительные реакции гликолиза. Снижение данной реакции приводит к ингибированию гликолиза в клетке.

НАДФ-зависимая декарбоксилирующая малатдегидрогеназа (НАДФМДГ) осуществляет окисление малата до пирувата. Фермент локализуется в цитоплазматическом компартменте и является конкурентом для Г6ФДГ за кофактор. Данный фермент является ключевым ферментом липидного анаболизма. НАДФМДГ также осуществляет шунтирующую реакцию для цикла трикарбоновых кислот, тем самым стимулируя интенсивность аэробных реакций.

Способ осуществляется следующим образом.

У больного с диагнозом острого лейкоза, независимо от стадии и типа заболевания, забирают венозную кровь из локтевой вены свободным током в пробирки с гепарином. Выделяют лимфоциты путем центрифугирования на градиенте плотности фиколл-верографина по стандартной методике A.Boyum. Подсчитывают концентрацию лимфоцитов, например в камере Горяева. Чистота выхода лимфоцитов должна составлять не менее 97%. Используют 1 млн выделенных клеток для определения активности Г3ФДГ и НАДФМДГ одним из известных способов, например биолюминесцентным [2]. Для этого суспензию выделенных лимфоцитов, содержащую клетки в концентрации 1,0 млн/мл разрушают путем осмотического лизиса с добавлением дистиллированной воды (1:5 по объему) и 1,0-2,0 мМ дитиотреитола. Затем непосредственно определяют активность дегидрогеназ. Для этого в 150 мкл инкубационной смеси, содержащей соответствующий субстрат и кофактор, вносят 50 мкл суспензии разрушенных лимфоцитов. Конкретные значения концентраций субстратов и кофакторов, а также рН среды для определяемых ферментов представлены в таблице.

Фермент Субстрат, мМ Кофактор, мМ РН буфера Г3ФДГ Глюкоза-3-фосфат - 0,5 НАД-0,35 9,8 НАДФМДГ Малат - 7,5 НАДФ-0,375 9,8

После инкубации исследуемых проб при 37°С в течение 30 минут к 200 мкл инкубационной смеси добавляют 50 мкл флавинмононуклеотида (ФМН) в концентрации 1,5×10¹⁵ М, 50 мкл 0,0005% миристинового альдегида и 10 мкл ферментативной системы НАДФН: ФМН оксидоредуктаза-люцифераза (все реактивы биолюминесцентной системы разводят в 0,1М К⁺, Na⁺ -фосфатном буфере с рН 7,0). После смешивания биолюминесцентных реактивов и инкубационной пробы с помощью биолюминометра, например марки "БЛМ-8803", измеряют свечение. Учитывая, что в клетках имеется определенное количество субстратов для течения различных метаболических реакций, в том числе и катализируемых исследуемыми ферментами, определяют показатели, условно названные "субстратный фон ферментов". Определение ведут в тех же условиях, что и для вышеперечисленных дегидрогеназ, но в инкубационную смесь вместо соответствующего субстрата вносят буфер. В результате измерения свечения на биолюминометре получают относительные значения активности исследуемых ферментов. Чтобы получить абсолютные значения активности, строят график зависимости интенсивности биолюминесценции от концентрации НАДФН (калибровочный график). Для этого 200 мкл стандартного раствора НАДФН в диапазоне 10^-9-10^-4 М вносят в кюветы биолюминометра, содержащие ФМН, миристиновый альдегид и НАДФН: ФМНоксидоредуктазу-люциферазу в концентрациях, указанных выше, после чего производят измерение интенсивности биолюминесценции. Активность дегидрогеназ рассчитывают по формуле:

где А - активность дегидрогеназы, Е на 10⁴ лимфоцитов (1Е=1 мкмоль/мин);

∆[С] - разница концентраций НАДФН в пробах "фермент" и "фонфермента", мкмоль;

V - объем пробы, мл;

Т - время инкубации, мин.

Возникновение рецидива у больных острым лейкозом прогнозируют, если значения активности Г3ФДГ находятся в интервале 0-0,02 мкЕ, а значения активности НАДФМДГ - в интервале 0,25-6,21 мкЕ.

Клинический пример 1. Больная Н., 58 лет, поступила на стационарное лечение в гематологическое отделение ККБ №1 г.Красноярска с диагнозом: острый миелобластный лейкоз, ремиссия. Больная поступила на очередной курс химиотерапии на поддержание ремиссии. При поступлении состояние больной средней степени тяжести, беспокоит сильная слабость.

Проведено обследование по заявленному способу.

Активность ферментов в лимфоцитах крови составила:

Г3ФДГ: 0,01 мкЕ (в интервале значений: 0-0,02 мкЕ)

НАДФМДГ: 5,04 мкЕ (в интервале значений: 0,25-6,21 мкЕ)

Уровни активности ферментов снижены, у больной прогнозируют развитие рецидива острого миелобластного лейкоза.

В показателях миелограммы больной найдено 45% бластов, диагностирован ранний рецидив и назначена полихимиотерапия на индукцию ремиссии.

Клинический пример 2. Больной М., 47 лет, поступил на стационарное лечение в гематологическое отделение ККБ №1 г.Красноярска с диагнозом: острый миелобластный лейкоз, ремиссия. При поступлении состояние больного средней степени тяжести, беспокоит выраженная слабость, повышенная утомляемость. Проведено обследование по заявленному способу.

Активность ферментов в лимфоцитах крови составила:

Г3ФДГ: 1,37 мкЕ (вне интервала значений: 0-0,02 мкЕ)

НАДФМДГ: 10,23 мкЕ (вне интервала значений: 0,25-6,21 мкЕ)

По результатам определения активности Г3ФДГ и НАДФМДГ развитие рецидива не прогнозируют: у больного ремиссия. В показателях миелограммы больного найдено 5% бластов, что подтвердило диагноз ремиссии. Больному назначен курс полихимиотерапии на поддержание ремиссии.

Данный способ апробирован на 70 больных острым миелобластным лейкозом и 65 больных острым лимфобластным лейкозом, проходивших лечение в гематологическом отделении Краевой клинической больницы №1 г.Красноярска. Активность Г3ФДГ и НАДФМДГ в лимфоцитах крови определяли с помощью биолюминесцентного метода. У 17 больных острым миелобластным лейкозом и 22 больных острым лимфобластным лейкозом был спрогнозирован рецидив заболевания, который в дальнейшем был подтвержден дополнительными методами исследования. У 1 больного острым миелобластным лейкозом и 2 больных острым лимфобластным лейкозом прогноз не совпал. По сочетанию активности Г3ФДГ и НАДФМДГ было спрогнозировано развитие рецидива, но рецидив не развился, диагностирована ремиссия заболевания. Таким образом, отмечено совпадение прогноза в 98,0%.

Технический результат от реализации предлагаемого способа:

- повышение точности прогнозирования развития рецидивов у больных острыми лейкозами за счет оценки особенностей метаболизма клеток иммунной системы;

- сокращение длительности исследования;

- возможность ранней диагностики рецидива острого лейкоза;

- расширение арсенала средств для прогнозирования возникновения

рецидива у больных острыми лейкозами.

Таким образом, предложенный высокочувствительный информативный способ позволяет своевременно диагностировать прогрессирование заболевания, корректировать план и тактику лечения данной категории больных и улучшить результаты их реабилитации.

Источники информации

1. Родосская Н.К., Черноусова Г.М. Способ прогнозирования рецидива у больных острым лейкозом. RU 2319151. Опубл. 10.03.2008.

2. Савченко А.А., Сунцова Л.Н. Высокочувствительное определение активности дегидрогеназ в лимфоцитах периферической крови человека биолюминесцентным методом. // Лаб. дело. - 1989. - №11. - С.23-25.

Изобретение относится к области медицины. Предложен способ прогнозирования рецидивов у больных острым лейкозом. В лимфоцитах периферической крови определяют активность глицерол-3-фосфатдегидрогеназы (Г3ФДГ) и НАДФ-зависимой декарбоксилирующей малатдегидрогеназы (НАДФМДГ). При сочетании активности Г3ФДГ в пределах от 0 до 0,02 мкЕ и активности НАДФМДГ в пределах от 0,25 до 6,21 мкЕ прогнозируют возникновение рецидива у больных острым лейкозом. Изобретение позволяет своевременно диагностировать прогрессирование острого лейкоза, корректировать план и тактику лечения данной категории больных и улучшить результаты их реабилитации. 2 пр., 1 табл.

Способ прогнозирования рецидивов у больных острым лейкозом путем исследования крови, отличающийся тем, что определяют активность двух дегидрогеназ - глицерол-3-фосфатдегидрогеназы (Г3ФДГ) и НАДФ-зависимой декарбоксилирующей малатдегидрогеназы (НАДФМДГ), и при сочетании активности Г3ФДГ в пределах от 0 до 0,02 мкЕ и активности НАДФМДГ в пределах от 0,25 до 6,21 мкЕ прогнозируют возникновение рецидива у больных острым лейкозом.