Способ получения гиалуронидазы Советский патент 1982 года по МПК A61K37/48 C12N9/26 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИАЛУРОНИДАЗЫ

Изобретение относится к производству лекарственных препаратов, применяемых в медицинской практике, и касается способа получения препаратов из животного сырья.

Известен способ получения гиалуронидазы КЗ семенников крупного рогатого скота путем экстракции сырья 0,1 н. водным раствором уксусной кислоты при перемешивании, отделения экстракта от жкнха и последующего высушивания 11.

Однако известный способ не обес/печив ет достаточно полного извлечения фермента гиалуронидазы (1,3%).

Целью изобретения является повышение выхода фермента.

Поставленная цель достигается тем, что в способе получения гиалуронидазы из семенников крупного рогатого скота путем экстракции сырья 0,1 н водным раствором уксусной .кислоты при перемешивании, отделения экстракта от KNUxa и последующего высушивания жмых обрабатывают 0,1 н, водным раствором уксусной кислоты, и экстракцию каждой последующей партии жмыха осуществляют экстрактом, по.ггученным от прпедыдущего извлечения с добавлением 0,1 н. водного раствора уксусной кислоты, при этом экстракцию проводят до насыщения извлечения ферментом, после чего полученное извлечение объединяют с экстрактом, полученным после обработки экстрагентом сырья.

Пример. 85 кг замороженных семенников крупного рогатого скота

10 измельчают дважды на волчке, добавляют 85 л 0,1 н. водного раствора уксусной кислоты, температуру смеси доводят до 20°С и экстрагируют при постоянном перемешивании в тече15ние 3 ч. Жмых отделяют сепарированием при 8000 об/мин, в течение 30 мин., а экстракт фильтруют. Около 100 кг жмыха заливают 300 л 0,1 н, водного раствора уксусной кислоты,

20 экстрагируют при 20°С и постоянном перемешивании 20 мин. Смесь подвергают сепарированию при 8000 об/мин в течение 30 мин., к 288 л полученного экстракта добавляют 0,1 н,

25 водный раствор уксусной кислоты до 300 л, переносят в 100 кг жмлха, полученного после экстракции другой партии семенников, экстракцию осуществляют аналогичным образом и

30 процесс повторяют с использованием

еще трех новых партий жйьтхов семенников (по 100 кг каждая). Экстракт, полученный после извлечения пятой партии жмыха, фильтруют на нутчфильтре, соединяют с экстрактом семенников. Объединенные фильтраты сгущают до 40 л, затем центрифугируют при 3000 об/мин в течение -20 мин., надосадочную жидкость отделяют и вливают тонкой струей в 4 объема (около 160 л охлажденного до 96%-ого этилевого спирта. Смесь тщательно перемешивают, оставляют на 2 ч при 0°С, образующийся осадок отделяют, промывают пять раз по 10 л ацетоном и два раза по 2 л серным эфиром и сушат в вытяжном шкафу до удаления запаха эфира. Выход порошка составляет 8,9 кг.

Гиалуронидазная активность и выход фермента при последовательной экстракции нескольких партий жмыхов семенников

Экстракция семенников 0,1 и водным раствором OHjCOOH по известному способу

Извлечение 1-Qfi партии жмыха семеннико 0,1,н. водный.раствором СНдСООН

Извлечение 11-ой партии жмыха семенников экстрагентом от п. 2

Извлечение 111-ей партии жмыха семенников экстрагентом от п. 3

Извлечение IV-ой партии Ж1чыха семенников экстрагентом от п. 4

Извлечение V-ой партии жмыха семеннико экстрагентом от п. Гиалуронидазная активность фермента, извлеченного из семенников и из жмыхов семенников на всех стадиях 5

После определения гиалуоонидаэной активности (512 ед. в 100 мг ) полученный порошок может быть использован для получения препарата Ронидаза. Для этого к полученному порошку добавляют 133,5 кг наполнителя (талька ), смесь перемешивают 2 ч 3 ш-аровой мельнице, затем расфасовывают во флаконы по 5 г и получают 26700 флаконов препарата ронидазы.

В таблице представлены эк-спериментальные данные, показывающие гиалуронидазную активность и выход фер1 юнта, полученного при последовательной экстракции нескольких партий жмыхов семенников одним и тем же экстрагентом. При этом происходит постепенное обогащение экстрагента ферментом ги алурон ида 3 о и.

64,0

1,30

1,3

5,0

0,20

0,2

0,49

0,245

9,5

41,0

1,433

0,48

2,50

0,62

78,0

83,0

0,60

3,00 ( п,п, 2-6), была олннаковой и выражалась величиноП ел.(100 мг тюРошка ).

Из 500 кг жмыха семенников по предлагаемому способу получают 7,62 кг фермеята гиалуронидазы с активностью 512 ед. в 100 мг, из которого после разбавления наполнителем до активности 32 ед. в 100 мг получают 121, 92 кгГотового препарата ронидаэы, или 24384 флаконов ронидазы (по 5 г во флаконе).

В целом, в дополнение к 1,3% фермента, извлекаемого из ткани семенников по известному способу, при использовании предлагаемого способа удается экстрагировать из жм хов семенников еще 2,74% фермента гиалуронидазы, что позволяет почти в семь раз увеличить выход готового препарата Ронидазы. Формула изобретения

Способ получения гиалуронидазы из семенников крупного рогатого скота путем экстракции с(1рья 0,1 н. водным раствором уксусной кислоты при перемешивании, отделения экстракта от жмыха и последующего высушивания, отличающийся тем, что,

с целью повышения выхода фермента, жмых обрабатывают 0,1 н. водным раствором уксусной кислоты и экстракцию каждой последующей партии жмыха осуществляют экстрактом, полученным от предыдущего извлечения с добавлением 0,1 н. водного раствора уксусной кислоты, при этом экстракцию проводят до насыщения извлечения ферментом, затем полученное извлечение объединяют с экстрактом, полученным после обработки экстрагентом сырья.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

Авторское свидетельство СССР № 566875, кл. А 61 К 37/48, 1976.