СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИАЛУРОНИДАЗЫ Российский патент 1999 года по МПК C12N9/26 

Изобретение относится к производству ферментов, а именно, к способу получения фермента гиалуронидазы /гиалуронат-3-гликаногидролаза КФ 3.2.1.3б/ из перспективного вида сырья - молок рыб.

Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому результату является способ получения гиалуронидазы из семенников половозрелого крупного рогатого скота, основанный на экстракции измельченных семенников водным раствором уксусной кислоты при pH 4,5 - 4,7 в атмосфере инертного газа и дальнейшей очистке экстракта обработкой его белой глиной /SU, авт.свид. N 1666534, кл. C 12 N 9/26, 1991/.

Однако в связи с недостаточностью дефицитного сырья, каким являются семенники крупного рогатого скота, актуальным является поиск другого доступного источника сырья, содержащего гиалуронидазу в количестве, достаточном для получения препарата в промышленном масштабе. Таким сырьем являются молоки рыб, большая часть которых в настоящее время составляет отходы рыбной промышленности.

Технической задачей изобретения является возможность использования перспективного источника сырья для получения гиалуронидазы.

Это достигается тем, что в способе получения гиалуронидазы, заключающемся в экстракции измельченного сырья водным раствором уксусной кислоты, отделении экстракта, очистке целевого продукта сорбцией и десорбции его с сорбента, согласно изобретению, экстракции подвергают измельченные молоки рыб при pH 4,0-4,5, сорбцию целевого продукта проводят на макропористом катионите при pH 4,0-4,5, а десорбцию - раствором сульфата аммония в растворе аммиака с последующим осаждением фермента сульфатом аммония, при этом после отделения экстракта подвергают фильтрации на нутч-фильтра.

Для десорбции следует использовать 0,5 - 1,0 H раствор сульфата аммония в 0,02-0,5 H растворе аммиака.

Осаждение фермента сульфатом аммония следует вести при степени насыщения 0,82-0,86.

Способ получения гиалуронидазы осуществляют следующим образом.

Предварительно измельченные молоки рыб подвергают экстракции 0,1 н раствором уксусной кислоты в течение 3-4 часов. Увеличение времени экстракции больше 4 часов нецелесообразно, так как может привести к уменьшению гиалуронидазной активности фермента в экстракте.

Экстракцию необходимо проводить при t=3-5^oC, так как это важно для стабилизации активности выделяемого фермента. Полученный экстракт подают на центрифугу, где разделяют на жмых и неосветленный экстракт. Затем экстракт сепарируют, при этом pH экстракта должен быть 4,3-4,8.

Экстракт молок, подаваемый на колонну с макропористым катионитом, должен быть абсолютно прозрачным, в противном случае, при сдвиге pH в щелочную сторону в процессе элюции возможно образование геля в колонне, что делает невозможным протекание раствора. В связи с этим осветленный экстракт после сепарирования передают на стадию дополнительной фильтрации на нутч-фильтре. Затем экстракт подают в сборник и охлаждают. Осветленный экстракт с t=+5^oC передают при помощи центробежного насоса из сборника на ионообменную колонну через расходомер со скоростью 50-150 мл/см. 2 час. После окончания сорбции колонну промывают дистиллированной водой в количестве, равном объему колонны. Затем осуществляют десорбцию с ионита путем подачи сверху вниз элюента со скоростью 25-75 мл/см. 2 час. В качестве элюента используют 0,5 - 1,0 н раствор сульфата аммония в 0,02-0,5 и раствора аммиака. pH элюента должно быть 8,5-9,0. Изменение pH больше значения 9,0 приводит к образованию геля и невозможности элюирования, а также к значительным потерям гиалуронидазной активности. Уменьшение скорости элюента приводит к размыванию целевого пика, увеличению его объема, что не дает достаточной степени концентрирования. После процесса десорбции проводят регенерацию катионита, чтобы его можно было использовать в дальнейшем. Полученный после десорбции элюат подают на стадию осаждения сульфатом аммония при степени насыщения 0,82 - 0,85.

Полученный высол растворяют в воде на стадию обессоливания.

Технический результат изобретения заключается в следующем:
1) возможность использования перспективного источника гиалуронидазы - молок рыб, являющихся отходом рыбной промышленности;
2) сырье хорошо измельчается, выход фермента практически не зависит от степени измельчения / см. таблицу/;
3) удельная гиалуронидазная активность молок рыб в 1,5 раза больше, чем удельная активность семенников /см. таблицу/;
4) при осаждении сульфатом аммония выделяются, в основном, мономерные, а не олигомерные формы гиалуронидазы /см. чертеж/;
5) удельная активность получаемого по данной технологии фермента из молок в 5 раз больше удельной активности субстанции препарата "Лидаза".

Способ иллюстрируется следующим примером.

Пример 1.

В качестве сырья для получения фермента используют молоки лососевых рыб. 50 кг замороженных молок лососевых рыб измельчают до величины частиц около 2 мм и подвергают экстракции 150 л и 0,1 н раствором уксусной кислоты при t= +5^oC в течение 3,5 часов при периодическом перемешивании. После окончания экстракции жмых отделяют на центрифуге, а экстракт сепарируют, подвергают дополнительной фильтрации на нутч-фильтре и охлаждают до t=+5^oC. Затем экстракт подают на ионообменную колонну, заполненную макропористым сульфокатионитом КУ-23 в H⁺-форме в количестве 30 кг. Скорость сорбции 10 мл/см. 2 час. Объем пропущенного экстракта 150 л pH 4,3. Затем сорбент промывают дистиллированной водой V=125 л и проводят десорбцию фермента 1 н раствором сульфата аммония в 0,03 н растворе аммиака, подавая элюент сверху вниз со скоростью 55 мл/см. 2 час при t=+5^oC. pH элюента 9,0. На выходе колонны собирают фракции объемом 5 л, в которых определяют количество белка по методу Лоури, фракции, содержащие более 2,5 мг/мл белка, объединяют, доводят pH элюента до 4,5 и проводят осаждение фермента сернокислым аммонием при степени насыщения 0,85.

Использование: изобретение относится к производству фермента гиалуронидазы из перспективного источника сырья - молок рыб. Сущность изобретения: для получения гиалуронидазы в качестве сырья используют молоки рыб, измельченное сырье подвергают кислотной экстракции. Затем экстракт центрифугируют, сепарируют. Осветленный экстракт фильтруют на нутч-фильтре и подают на колонну с макропористым катионитом. Элюцию фермента с носителя проводят при рН, меньшем или равном 9,0, так как при pH больше 9,0 протекание раствора затрудняется образованием геля. Высаливание сернокислым аммонием проводят при степени насыщения 0,82-0,85 для выделения мономерных форм гиалуронидазы. 2 з.п. ф-лы, 1 ил., 1 табл.

1. Способ получения гиалуронидазы, заключающийся в экстракции измельченного сырья водным раствором уксусной кислоты, отделении экстракта, очистке целевого продукта сорбцией и десорбции его с сорбента, отличающийся тем, что экстракции подвергают измельченные молоки рыб при рН 4,0 - 4,5, сорбцию целевого продукта проводят на макропористом катионите при рН 4,0 - 4,5, а десорбцию - раствором сульфата аммония в растворе аммиака с последующим осаждением фермента сульфатом аммония, при этом после отделения экстракт подвергают фильтрации на нутч-фильтре. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что для десорбции используют 0,5 - 1,0 Н раствор сульфата аммония в 0,02 - 0,5 Н растворе аммиака. 3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что осаждение сульфатом аммония ведут при степени насыщения 0,82 - 0,86.