Способ получения гиалуронидазы Советский патент 1992 года по МПК C12N9/26 

Изобретение относится к производству ферментных препаратов, применяемых в медицинской практике, а именно к способу получения гиалуронидазы, используемой для приготовления препаратов Ронидаза и Лидаза, оказывающих положительное действие прм лечении контрактур и тугопод- вижности суставов, рубцов, длительно игеза- живающих ран и язв.

Цель изобретения - повышение выхода и активности фермента, а также сокращение времени его получения.

Способ осуществляют следующим образом.

Измельченные семенники крупного рогатого скота заливают водным раствором

уксусной кислоты при рН 4,5-4,7, добавляют поливинилхлорид из расчета 20-40 г на 1 кг сырья и лактат кальция из расчета 1-2 г на 1 кг. Экстракцию проводят при 60-70° 30-40 мин при постоянном перемешивании. Жмых отделяют сепарированием, в экстракте после охлаждения осаждают гиалурони- дазу водным раствором гидроокиси натрия при рН 6,2-6,8 с последующим переосаждением этиловым спиртом и досушиванием на воздухе.

Поливинилхлорид получают суспензионной или эмульсионной полимеризацией винилхлорида, молекулярная масса около 150000, плотность 1,35-1,43 г/см3, т.пл. 150-200°, не растворим в воде и спиртах.

v4 Ю 03

Ю К)

растворим в циклогексане и тетрагидрофу- ране.

Выход целевого продукта 10-12% от массы сырья, а его активность 2048-4096 ед/100мг.

П ример 1.100 кг семенников крупного рогатого скота измельчают дважды на волчке, добавляют 100 л 0,1 н. водного раствора уксусной кислоты (жидкостной коэффициент 1:1), 2 кг поливинилхлорида (20 г/кг сырья) и 0,1 кг лактата кальция (1 г/кг сырья), устанавливают рН 4,5 и проводят экстракцию при 60°С и постоянном перемешивании 30 мин. Жмых отделяют сепарированием, а к 115 л экстракта осторожно добавляют после охлаждения до 20°С 0,1 н. раствор NaOH до рН 6,2, образовавшийся осадок отделяют центрифугированием, растворяют в 3 л воды, раствор фильтруют и фильтрат вливают в 12 л (4 объема) охлаж- денного до 4°С этилового спирта, образовавшийся осадок отделяют, промывают многократно спиртом и досушивают на воздухе. Получают 10 кг порошка гиалуронида- зы (выход 10% от массы сырья) с величиной гиалуронидазной активности 2048 ед/100 мг.

П ример2.100 кг семенников крупного рогатого скота измельчают дважды на волчке, добавляют 150 л 0,1 н, водного раствора /ксусной кислоты (жидкостной коэффициент 1:1,5), 3 кг поливинилхлорида (30 г/кг сырья) и 0,15 кг лактата кальция (1,5 г/кг сырья), устанавливают рН 4,6 и проводят экстракцию при 65°С и постоянном переме- шивании 37 мин, жмых отделяют сепарированием, а к 145 л экстракта осторожно добавляют после охлаждения до 22°С 0,1 н. раствор NaOH до рН 6,4, образовавшийся осадок отделяют центрифугированием, рас- творя ют в 4 л воды, раствор фильтруют и фильтрат вливают в 16 л (4 объема): охлажденного до 5°С этилового спирта, образовавшийся осадок отделяют многократно Прозывают спиртом и досушивают на воз- духе. Получают 11кг (выход 11 % от массы сырья) порошка гиалуронидазы с величиной гйалуронидазой активности 4096 ед/ 100мг,

П риме рЗ. 100кгсеменников крупного рогатого скота измельчают дважды на волч- ке, добавляют 200 л 0,1 н. водного раствора уксусной кислоты (жидкостной коэффициент 1:2), 4 кг поливинилхлорида (40 г/кг сырья) и 0,2 кг лактата кальция (2 г/кг сырья), устанавливают рН 4,7 и проводят экстракцию при 70°С и постоянном перемешивании 40 мин, жмых отделяют сепарированием, а к 175 л экстракта осторожно добавляют после охлаждения до 25°С 0,1 н. раствор NaOH до рН 6,8, образовавшийся

осадок отделяют центрифугированием, растворяют в 5 л воды, раствор фильтруют и фильтрат вливают в 20 л (4 объема) охлажденного до 6°С этилового спирта, осадок отделяют, многократно промывают спиртом и досушивают на воздухе. Получают 12 кг (выход 12% от массы сырья) порошка гиалуронидазы с величиной гиалуронидазной активности 4096 ед/мг.

Пример 4.100 кг семенников крупного рогатого скота измельчают дважды на волчке, добавляют 100 л 0,1 н. водного раствора уксусной кислоты и далее поступают как в примере 1, за исключением того, что экстракцию проводят 30 мин при 50°С. Получают 8 кг порошка гиалуронидазы (выход 8% от массы сырья) с активностью 2040 ед/100 мг.

П римерб. 100 кг семенников крупного рогатого скота измельчают дважды на волчке, добавляют 100 л 0,1 н. водного раствора уксусной кислоты и далее поступают, как в примере 1, за исключением того, что экстракцию проводят 30 мин при 80°С. Получают 10 кг порошка гиалуронидазы (выход 10% от массы сырья) с активностью 512 ед/100 мг.

П ри ме рб. 100 кг семенников крупного рогатого скота измельчают дважды на волчке, добавляют 100 л 0,1 н. водного раствора уксусной кислоты, 1 кг поливинилхлорида (10 г/кг сырья) и 0,05 кг лактата кальция (0,5 г/кг сырья) и далее поступают как в примере 1, Получают 8 кг порошка гиалуронидазы с активностью 64 ед/100 мг.

Пример. 100 кгсеменников крупного рогатого скота измельчают дважды на волчке, добавляют 100 л 0,1 н. водного раствора уксусной кислоты и 2 кг поливинилхлорида и далее поступают как в примере 1. Получают 10 кг порошка гиалуронидазы (выход 10% от массы сырья) с активностью 256 ед/100 мг.

П римерВ. 100 кг семенников крупного рогатого скота измельчают дважды на волчке, добавляют 100 л 0,1 н. водного раствора уксусной кислоты и 0,1 кг лактата кальция (1 г/кг сырья) и далее поступают как в примере 1. Уже через 10 мин после начала экстракции образуется резиноподобный осадок, почти не растворимый в воде, не обладающий гиалуронидазной активностью.

П римерЭ. 100 кг семенников крупного рогатого скота измельчают дважды на волчке, добавляют 100 л 0,1 н. водного раствора уксусной кислоты и далее поступают как в примере 1, за исключением того, что в экстракте после отделения жмыха устанавливают рН 5,8. Получают 4 кг порошка (4% от массы сырья) с величиной гиалуронидазной активности 64 ед/100 мг.

П р и м е р 10. 100 кг семенников крупного рогатого скота измельчают дважды на волчке, добавляют 100 л 0,1 н. водного раствора уксусной кислоты и далее поступают как в примере 1, за исключением того, что в экстракте устанавливают рН 7,2. Получают 5 кг порошка (выход 5% от массы сырья) с величиной гиалуронидазной активности 64 ед/100мг.

В таблице приведен сопоставительный анализ технико-экономических показателей предлагаемого и известного способа.

Из таблицы видно, что процесс получения гиалуронидазы по предложенному способу занимает- меньше времени (на 6-10 ч) по сравнению с известным. При этом увеличивается выход целевого продукта (на 2- 3%) и его гиалуронидазная активность (примерно в 2 раза).

0

5

Формула изобретения

Способ получения гиалуронидазы, предусматривающий экстракцию фермента из измельченных семенников крупного рогато- .го скота водным раствором уксусной кислоты при рН 4,5-4,7, последующую очистку и сушку, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода и активности фермента, а также сокращения времени его получения, экстракцию проводят при 60-70°С в течение 30-40 мин в присутствии поливинилхло- рида и лактатз кальция, которые вносят в количестве соответственно 20-40 г и 1-2 г на 1 кг сырья, а очистку проводят путем осаждения гиалуронидазы из экстракта водным раствором гидроокиси натрия при рН 6,2-6,8 и переосаждения этиловым спиртом.

20

Изобретение относится к производству ферментных препаратов, применяемых в медицинской практике, а именно к способу получения гиалуронидазы, используемой для приготовления препаратов Ронидаза и Лидаза, оказывающих положительное действие при лечении контрактур и тугопод- вижности суставов, рубцов, длительно незаживающих ран и язв. Цель изобретения - повышение выхода и активности фермента, а также сокращение времени его получения. Изобретение заключается в том, что проводят экстракцию измельченных семенников крупного рогатого скота водным раствором уксусной кислоты при рН 4,5-4,7, температуре 60-70°С в течение 30-40 мин и;в при- .сутствии поливинилхлорида и лактата кальция при их соотношении соответственно 20-40 г и 1-2 г на 1 кг сырья с последующей очисткой осаждением гиалуронидазы из экстракта водным раствором гидроокиси натрия при рН 6,2-6,8 и переосаждением этиловым спиртом и сушкой фермента. 1 табл. Ј

Величину гиалуронидазной активности определяли по методу предупреждения образования муцинового сгустка, описанному в ВФС 42-182-72 на Лидазу