Способ концентрирования и очистки вирусных суспензий Советский патент 1982 года по МПК C12N7/00 

(5) СПОСОБ КОНЦЕНТРИРОВАНИЯ И ОЧИСТКИ ВИРУСАХ СУСПЕНЗИЙ

Изобретение относится к вирусологии и может быть использовано в меди цинской и микробиологической промышленности. Известен способ концентрирования и очистки вирусных суспензий путем пропускания вируссодержащей жидкости через полимерные мембраны 1J. Однако известный способ не обес-. печивает высокой степени очистки и концентрирования целевого продукта. Целью изобретения является повышение степени очистки и концентрирования целевого продукта. Цель достигается тем, что при осу ществлении способа концентрирования очистки вирусных суспензий путем про пускания вируссодержащей жидкости через полимерные мембраны, в качеств полимерных мембран используют полисульфонамидные мембраны с размерами пор 500-2500 А и пропускают вируссодермащую жидкость при избыточном давлении О,75-1,О ати в непрерывном режиме, и при избыточном давлении 1,0-5,0 ати в статическом режиме. Пример ,1. 0,б5 л В/Ш, вирус гриппа А1 (Уфа), антигенная формула Hjjii, с титром в РГА 1:128 подвергают микрофильтрации в непрерывном режиме и в режиме диафильтрации в буферном растворе с рН 7,2. Производительность составляет 0,05 мл/см мин. Получают 11,5 мл концентрата с титром в РГА 1:16000. Содержание белка, выход по вирусу и белку указаны в таблице. Пример 2. 2л ВАЖ, вирус гриппа А1 (Уфа), с титром 1:128 подвергают микрофильтрации, как указано в примере 1. 200 мл концентрата с титром 1:32000 обрабатывают коагулянтом, осадок отделяют центрифугированием (200 об/мин, 20 мин), фильтрат (супернатант) концентрируют микрофильтрацией до 50 мл, титр 1:128000. а затем до 8 мл (т.е. в 250 раз). Содержание белка, выход по вирусу и белку приведены в таблице. Пример 3- 0,75 л ВАЖ, вирус гриппа А2(Техас) 1/77, антигенная формула Не NAJJ , титр 1:512 подвергаю микрофильтрац, как указано в приме ре 1. 175 мл концентрата отмывают в режиме диафильтрацми а буферном раст воре с рН 7,2. Получают 175 мл отмытого концентрата с титром IrlOZiO (см. таблицу)-. Далее концентрируют в статических условиях до конечного объема 9,2 мл (титр 1:51200). Пример k. 0,92 л ВАН, вирус гриппа А2 (Техас) 1/77, титр :20kS подвергают микрофйльтрации в стационарном режиме. Получают 92 мл концентрата с титром 1:20480. Концентрат обрабатывают коагулянтом, осадок отделяют на центрифуге, как указано в примере 2, супернатант отмывают в режиме диафильтрации, затем концентрируют. Получают 31 мл концентрата с титром (см. таблицу). Пример 5. 0,53 л ВАН(, вирус гриппа В (Ленинград) титр 1:512 подвергают микрофильтрации, как указано в примере 1. Получают 11,5 мл концентрата с титром 1:32000. Содержание белка указано в таблице. Пример 6.1.18л ВАН, вирус гриппа X-i) (Ленинград), антигенная формула НуМ|, титр 1:16 подвергают микрофильтрации, как указано в при мере 1. Получают 200 мл концентрата, который отмывает от примесей в режиме диафильтрации до поглощения в фильтрате при /1 280 нм не более 0, Титр концентрата ЛОЭ(, содержание белка указано в таблице. Пример 7. 5л ВАМ, рекомбинантный штамм вируса гриппа Nib-, антигенная формула И„и,титр 1:128 подвергают микрофйльтрации в непрерывном режиме. Получают 500 мл концентрата с титром 1:102. Содерхсание белка дано в таблице.

Пример 8. 30 л ВАй, вирус гриппа А1 (Уфа), титр 1:1024.подвергают микрофильтрации, как указано ° в примере 1. Получают 2,3 л концентрата с титром 1:10240.

Пример 9. 2,8 л КМ вируса эпидемического паротита, штамм Ленинград-3, титр 8 РГА менее 1:2 подвергают микрофйльтрации в сатическом режиме. Производительность при 1 ати составляет 0,08 мл/см мин. 200 мл

Пример12. 2,5лК клещевого энцефалита подвергают микрофйльтрации в непрерывном режиме со средней скоростью фильтрации 2,3 мл/ч/см. Получают 40 мл концентрата. Концентрацию вируса определяют методом флуоресциирующих антител и по инфекционной активности на мышах. концентрата отмывают от примесных белков в режиме диафильтрации при ати в буфере с рН б, до поглощения, в фильтрате при /X 280 нм не более 0,1- Далее концентрируют в статическом режиме. Получают 45 мл концентрат та, титр в РГА 1 :64, концентрация белка 1,35 мг/мл, содержание белка 60,75 мг, что составляет 6,1 от суммарного белка, присутствующего в исходной Кй. Далее концентрируют до 3,0 мл, титр 1:102. Пример 10.0,2лКЖ вируса клещевого энцефалита, штамм Софьин подвергают микрофильтрации в статическом режиме ,при 5 ати. Начальная скорость 50 мл/ч, конечная - 10 мл/ч. Получают 3,2 мл концентрата. Концентрацию вируса определяют по цитопатогенному действию на культуре СПЭВ. В фильтрате инфекционной активности не обнаружено. При концентрировании примерно в 60 раз наблюдают увеличение концентрации белка в Л8 раз (с 2,5 до 120,37 мг/мл) и возрастание концентрации вируса примерно в 100 раз. . - --. fl р и м е р 11. Культуральную жидкость (КЖ) вируса клещевого знцефалита, штамм Софьин, в объеме 0,18 л подвергают микрофильтрации в статическом режиме на ПСА-мембранах с диаметром пор 640 А при давлении 5 ати со средней скоростью фильтрации 0,97 мл/ч/см. Получают 3,3 мл концентрата. Концентрацию белка определяют по Лоури. Концентрацию вируса определяют по инфекционной активности на мышах и вырахсают оощепринятым способом в виде ,03 мл. Получено: До концент- После рирования концентрирования

Получено: До концент- После рирования концентрированиБелок, мг/мл gLD П р и м 6 р 13« Концентрируют в рус бешенства, фиксировднный штамм Внуково-32, выращенный на первичной культуре клеток почек сирийских хомячков. Поддерживающая среда содержит 0,25% гидролизата лактальбумина и 5 аминопептида. Концентрирование проводят в непрерывном режи на аппарате 0Т-01 при давлении 1,5 эти. Скорость фильтрации 5,3 мл/ч/cм a мембране с диаметром пор 1700 Л. Из З, л КК получают 175 ил концентрата. Вирус определяю ;по титру в РГА. Титр в РГА в исходной КЖ 1:4, в концентрате (1:64)(1:128). П р и-м е р 14. 3,0 л ВАЖ, {Виру гриппа, штамм А/Ленинград/399/76/ /Н, Н;5 4 / онцентрируют на ПСА-мембра не с диаметром пор 2000 А и пористостью В0% в непрерывном режиме до конечного объема 0,3 л. Концентраци вируса определяют в РГА, а также по инфекционной активности путем зараж ния куриных эмбрионов/ Получено: До концент- После конрирования центрирова ния Белок, мг/мл 1,45

600 1:128 2,4

А1 (Усра) 2200 1:128 4,6 А1 (Уфа)

750 1:512 3,1 920 1:2048 1,8

1:1024

Титр в РГА

1:8192

43,9

1:1640

100

55 32 68 1:3200 69,0 100 1:12810 37,0

1оа

42,0

1:10240 5,6

100 23,5 1:20480 4,3 100 Инфекционная активность в ЭИД 6,5 7,5 Сохранение инфекционной активное ти вирусов, возрастание гемагглютинирующей активности в концентратах свидетельствуют об отсутствии ингибирующего действия полисульфонамидных мембран на биологические свойства вирусов. Предлагаемый способ концентрирования и очистки вирусных суспензий позволяет существенно повысить технологичность процесса, а именно: про водить одновременное концентрирование и очистку вирусов из растворов с высоким содержанием белка (например, непосредственно из исходной ВАЖ с концентрацией белка мг/мл), концентрировать и очищать вирусы из больших объемов - до 30 л ВАЯ и КЖ; работать в статическом и непрерывном режимах, а также в режиме диафильтрации; по.единой технологии (с сохранением мембран и оборудования) проводить концентрирование и очистку различных вирусов. Способ позволяет повысить степень очистки вируса, а именно, в одну стадию удалить 40-90 примесного белка BAR (в случае вируса гриппа) и до 95% примесного белка (в случае КН вируса паротита), а такме повысить степень концентрирования вируса от 6-кратного по известному способу, до 3t)0-кратного в случае ВАМ и до 1000-кратного в случае КК.

Формула изобретения

Способ концентрирования и очистки вирусных суспензий путем пропускания вируссодериащей жидкости через полимерные мембраны, бтличающийс я тем, что, с целью повышения степени очистки и концентрирования целевого продукта, в качестве полимерных мембран используют полисульфонамид975795

8 Продолжение таблицы

ные мб лбраны с размерами пор 5002500 А и пропускают вируссодермащую жидкость при избыточном давлении 0, ати в непрерывном режиме и при избыточном давлении 1, ати в статическом режиме.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Авторское свидетельство СССР № 520778, кл. С 12 К 7/00, 1975.