СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЖИВОЙ ГРИППОЗНОЙ ВАКЦИНЫ Российский патент 1995 года по МПК A61K39/145 

Изобретение относится к медицинской биотехнологии и может быть использовано в производстве противогриппозных препаратов.

Известен способ получения живой гриппозной вакцины путем накопления вакцинного штамма вируса гриппа в культуре ткани с последующим сбором вирусосодержащего материала и лиофилизацией (авт.св. СССР N 303806, 1973).

Однако данный способ трудоемок и неэкономичен из-за необходимости использования культуры клеток. Кроме того, получаемый целевой продукт обладает низкой иммунологической активностью, (Руководство по вакцинному и сывороточному делу. М. Медицина, 1978, с.232-236).

Известен также способ получения живой гриппозной вакцины путем накопления вируса в аллантоисной жидкости куриного эмбриона с последующим отделением вируссодержащей аллантоисной жидкости (ВАЖ), стабилизацией и лиофилизацией целевого продукта (авт.св. СССР N 174327 1964). Вариант этого способа предусматривает использование в качестве продуцента рекомбинанта А(РР)8/34 с эпидемическим штаммом вируса гриппа (патент США N 4338296, 1982).

Этот способ также не обеспечивает высокой иммунологической активности вакцины, что подтверждается низким процентом сероконверсий у серонегативных лиц (см. Шадрин А. С. и др. Сравнительная оценка эффективности массового применения живых и инактивированных гриппозных вакцин. Вакцинопрофилактика и иммунология гриппа, Л. ВНИИ гриппа, 1980, с.48-55), а в варианте по патенту США N 4338296 не гарантируется авирулентность вакцины (см. Зазимко Л.А. Изучение вирулентности вирусов гриппа и факторов, влияющих на ее проявление. (Автореф. на соиск. учен. степени д-ра мед.наук, Л. 1987).

Наиболее близким к заявляемому является способ получения живой гриппозной вакцины путем выращивания вируса гриппа в развивающихся куриных эмбрионах с последующим отделением вируссодержащей аллантоисной жидкости, ее осветлением с помощью низкоскоростного центрифугирования, стабилизацией вируса обработкой пептоном и его лиофилизацией (авт.св. СССР N 1125815, 1983).

Недостатком данного способа являются низкая иммунологическая эффективность защиты взрослого населения (эпидэффективность) получаемой вакциной, а также возможность аллергических реакций на ее введение.

Предлагаемый способ позволяет повысить иммуногенность и снизить аллергизирующее действие вакцины.

Это достигается тем, что в способе получения живой гриппозной вакцины, предусматривается выращивание вируса гриппа в развивающихся куриных эмбрионах с последующим отделением вируссодержащей аллантоисной жидкости, осветлением, стабилизацией и лиофилизацией вируса, выращивают вирус с индексом инфекционность гемагглютинин не менее 7,0, а вируссодержащую аллантоисную жидкость подвергают дополнительной очистке ультрацентрифугированием в градиенте плотности сахарозы или микрофильтрацией.

Предлагаемый способ основан на впервые установленной неизвестной ранее закономерности увеличения иммуногенности живой гриппозной вакцины за счет повышения степени ее очистки. Этим и объясняется введение дополнительной очистки вируса. Дополнительная очистка здесь неочевидна еще и потому, что получаемая вакцина предназначена для интраназального применения.

Использование индекса инфекционность (гемагглютинин позволяет стандартизовать вирусные суспензии различных штаммов вируса гриппа с учетом содержания в них дефектных вирусных частиц (неполного вируса) (В кн. "Вирусы гриппа и грипп, М. Медицина, 1978, с.276; Barry R.D. Virology, 1961, v.14, 389; von Magnus P. Advan. virus. Res. 1954, v.2, р.59).

Как видно из приводимых ниже примеров, использование вируса гриппа с меньшим значением данного индекса приводит к резкому снижению иммуногенности вакцины. Поэтому использованию предлагаемого способа должно предшествовать получение исходного вирусного материала с индексом I≥7, например по Barry R. D. Virology, 1961, 14, р.389. В зависимости от рациона питания птиц продуцентов эмбрионов меняется содержание белка в аллантоисной жидкости. При высокой концентрации общего белка C_б≥0,3 мг/мл вариант очистки микрофильтрацией в режиме концентрирования с последующей диафильтрацией (см. например авт.св. СССР N 1126308, 1985), невозможен, что поясняется данными табл.1.

В табл. 1 приведены результатов очистки ВАЖ с антигенной структурой А(НINI), А(Н3N2) и В предлагаемым вариантом способа, а также по функциональному аналогу.

Операции микро- и диафильтрации проводили на плоскопараллельных фильтровальных аппаратах, укомплектованными мембранами с величиной пор 200-300 , при этом диафильтрацию проводили фосфатным буферным раствором (ФБП) рН 7,2.

Как видно из табл. 1, при концентрации белка в исходной ВАЖ менее 0,3 мг/мл наиболее близкий по сущности предлагаемому изобретению способ обеспечивает приемлемую степень очистки, тогда как при С_б ≥0,3 мг/мл высокая степень очистки (до содержания белка не более 0,18 мг/мл) достигается только в варианте с предшествующей диафильтрацией ВАЖ.

Наиболее вероятно, что причинно-следственная связь внесенного изменения стадии микрофильтрации с повышением степени очистки вируса заключается в том, что предшествующая диафильтрация ВАЖ предотвращает на стадии микрофильтрации (концентрирования) образование крупных белково-полисахаридных и белково-липидных комплексов, соизмеримых с величиной пор мембраны, которые, концентрируясь над мембраной, препятствуют выходу белка в фильтрат.

Способ поясняется следующими примерами.

П р и м е р 1. Вакцину получают из трех партий ВАЖ штамма вируса гриппа А(Новошахтинск)3/86 (HINI), инфекционная и гемагглютинирующая активность (в дальнейшем ИА и ГА соответственно) которых указана в табл.2. В этой же таблице приведены значения индекса ИА/ГА. Например, для второй партии ВАЖ он равен: I lg ИА lg ГА 9,1-2,1 7,0.

Для освобождения от надмолекулярных образований ВАЖ осветляют фильтрованием через двухслойный материал следующего состава: первый слой хлопок 30% стекловолокно УТВ 70% второй слой хлопок 70% стекловолокно УТВ 30% как это описано в авт. св. СССР N 1632039, 1988. Характеристики осветленной ВАЖ приведены в табл. 2. Способ осуществляют в варианте с микрофильтрацией. В связи с тем, что во всех партиях осветленной ВАЖ С_б≥0,3 мг/мл, стадию микрофильтрации выполняют в режиме диафильтрации ВАЖ с последующей микрофильтрацией (концентрирова- нием) и повторной диафильтрацией вирусного концентрата через мембраны с размером пор фильтрационных мембран 200 на всех операциях. Диафильтрацию проводят 0,01М ФБР рН 7,2 с 0,15М NaCl. Данные операции проводят при 9^оС. Диафильтрацию ВАЖ проводят под контролем абсорбциометра до максимальной степени очистки. Микрофильтрацию проводят до десятикратного уменьшения объема жидкости в режиме тангенциального потока. Повторную диафильтрацию осуществляют десятью объемами того же буферного раствора. О степени очистки целевого и промежуточного продуктов можно судить по приведенным в табл.2 значениям концентраций общего белка С_б и овальбумина С_ов.

Полученный очищенный вирусный концентрат стабилизируют путем разведения 1: 5,6 гидролизином, дополнительно содержащим 0,02% сывороточного альбумина человека (САЧ), и подвергают стерилизующему фильтрованию через предфильтр и каскад мембран с уменьшающимся по ходу потока размером пор: 1,2; 0,8; 0,65; 0,45; 0,22 нм. В стерильный концентрат вносят протектор лиофилизации желатиноль и Д-сорбит из расчета по 2,5 мас. каждого. Концентрат разливают по ампулам и лиофилизируют из замороженного до -40^о С состояния в вакуум-сушильном аппарате. Технические характеристики данных серий вакцин включены в табл.2.

Полученные серии вакцины испытывали на 150 добровольцах.

В качестве контролей используют неочищенную живую гриппозную вакцину, полученную по авт.свид СССР N 174327, и плацебо (апирогенный физиологический раствор). Вакцины предварительно разводят дистиллированной водой до исходного объема. Схема иммунизации: однократное и двукратное (с интервалов 28 дней) введение препаратов с помощью распылителя по 0,25 мл в каждый носовой ход.

Иммуногенную активность препаратов оценивали по уровню антигемагглютининовых антител в РТГА, антинейраминидазных антител в реакции ингибиции-элюции (РИЭ) и продукции секреторных IgА. Аллергизирующие свойства препаратов оценивали по способности индуцировать синтез антител к овальбумину и неовальбуминовым компонентам, а также по величине эозинфильно-лимфоцитарного индекса (табл. 2). В табл.2 и далее приняты следующие обозначения этих показателей качества вакцины:
АГ-АТ уровень антигемагглютининовых антител в процентах сероконверсий у серонегативных лиц;
АН-АТ уровень антинейраминидазных антител в процентах сероконверсий у серонегативных лиц;
N_IgА процент повышения содержания секреторных IgВ у привитых;
N_ов процент сероконверсий привитых к овальбумину;
N_нов процент сероконверсий привитых к неовальбуминовым компонентам;
ЭЛИ эозинофильно-лимфоцитарный индекс у привитых.

Значения показателей даны по результатам двухкратной иммунизации. Для АГ-АТ в скобках даны значения при однократной прививке.

Как видно из табл. 2, вакцина, полученная из ВАЖ с I 6,1 (серия N 1), обладает низкой (по уровню неочищенной вакцины по авт.свид. N 174327) иммуногенной активностью, а именно: АГ-АТ 50% АН-АТ 30,8% В то же время вакцины из ВАЖ с I 7,0 и I 7,4 (серии NN 2 и 3) обладают существенно большей иммуногенностью: АГ-АТ о 75 до 83,3% АН-АТ от 60 до 70,6% При этом значения АГ-АТ превосходят контроли даже при однократной вакцинации. Такой результат является неожиданным, поскольку инфекционная активность полученных предлагаемым способом вакцин ниже, чем у неочищенной вакцины (значения ИА вакцин приведены в табл. 2). Резкое повышение значения N_IgА на введение очищенной вакцины по сравнению с контрольной вакциной (52,9 против 28,6%) свидетельствует о более эффективном стимулировании секреторного иммунитета.

Из анализа приведенных значений показателей аллергенности (N_ов, N_нов, и ЭЛИ) видно, что аллергизирующая способность целевого продукта существенно снижена. Снижение аллергизирующей способности дополнительно проверено на двух группах по 5 собак, сенсибилизированных овальбумином. Контрольная вакцина (авт.свид. СССР N 174327) вызывает выраженный бронхоспазм у всех собак, тогда как вакцина серий NN 2 и 3 такого синдрома не вызывает. Анализ этого испытания по критерию Стъюдента для малой выборки свидетельствует о том, что факт снижения аллергенных свойств полученных предлагаемым способом вакцин статистически значим при р < 0,05.

П р и м е р 2. Вакцину получают из пяти серий ВАЖ штамма вируса гриппа В/Ленинград/45/89, Р5. ВАЖ осветляют как в примере 1. Значения ИА, ГА и ВАЖ указанных в табл.3.

Поскольку ВАЖ 1-й серии имеет С_б 0,24 ≅0,3, ее подвергают микрофильтрационной очистке сначала микрофильтрацией (концентрированием, а затем диафильтрацией концентрата 2-ю и 3-ю серии (общая партия ВАЖ), а также 4-ю и 5-ю серии (тоже из общей партии ВАЖ) чистят с предварительной диафильтрацией и без нее. Режимы операций стадии микрофильтрации устанавливают как в примере 1.

Полученные серии полуфабрикатов вакцины сохраняют исходную инфекционную активность. При этом при десятикратной степени концентрирования вируса по объему содержание белка в сериях 1-4 не превышает 0,2 мг/мл. Вместе с тем, серия N5, полученная без предварительной диафильтрации ВАЖ, имеет высокое содержание белка С_б 5,3 мг/мл и поэтому она не пригодна для приготовления вакцины.

Вирусные концентраты серий NN 1-4 стабилизируют и лиофилизируют как в примере 1.

П р и м е р 3. ВАЖ из штамма вируса гриппа А/Закарпатье/17/89 (Н3N2) c ИА 9,25 lg ЭИД₅₀, ГА 2,1 (титр в РГА 1;128), I 9,25-2,1 7,15 осветляют как в примере 1. Осветленная ВАЖ имеет концентрацию общего белка 2,7 мг/мл, овальбумина 1000 мкг/мл.

Очистку и концентрирование вируса проводят изоплотностным центрифугированием в градиенте плотности сахарозы 30-56% в зональном роторе при 30 тыс. об/мин в течение 2,5 ч. Далее производят фракционирование вытеснением концентрата из ротора центрифуги 60%-ной сахарозой под контролем рефрактометра. Фракции в зоне плотности сахарозы 35-48% объединяют и разводят 0,01М ФБР рН 7,2 с 0,15М NaCl в соотношении 1:3. Разведенный концентрат имеет ИА 9,66 lg ЭИД₅₀ при концентрациях общего белка и овальбумина 1,8 и 9092 мг/мл соответственно.

Данный концентрат стабилизируют, стерилизуют и лиофилизируют как в примере 1. Полученную живую гриппозную вакцину с содержанием овальбумина 2 мкг/мл и ИА 7,1 lg ЭИД₅₀ использовали для прививки 115 взрослых людей. Схема вакцинации описана в примере 1. Уровень сероконверсий антигемагглютиновых антител у серонегативных лиц (53 чел.) составил 83% при этом у лиц с начальным титром антител менее 1:10 (12 чел.) наблюдали 100% сероконверсий.

П р и м е р 4. ВАЖ из штамма вируса гриппа А/Ленинград/92/89 (НINI) с ИА 9,5 lg ЭИД₅₀, ГА 2,5, I 9,5-2,5 7,0 осветляют низкоскоростным центрифугированием в течение 40 мин при 3000 об/мин.

Осветленная ВАЖ имеет концентрацию общего белка 3 мг/мл, овальбумина 1500 мкг/мл.

Очистку, концентрирование и фракционирование вируса проводят как в примере 3. Разведенный с помощью ФБР в соотношении 1:3 вирусный концентрат имеет ИА 10,0 lg ЭИД₅₀ при концентрациях общего белка и овальбумина 1,6 и 0,03 мг/мл соответственно.

В данный концентрат добавляют 4,6 объема стабилизирующей среды следующего состава, мас. L-аргинин 2,0; L-глютамин 1,0; L-метионин 1,5; лактоза 5,0; САЧ 0,02, среда 199 остальное.

Разведенный вирусный концентрат стерилизуют и лиофилизируют как в примере 1. Получают живую гриппозную вакцину с содержанием овальбумина 3 мкг/мл и ИА 7,3 lg ЭИД₅₀.

Полученной вакциной однократно прививали 160 взрослых людей. Схема вакцинации описана в примере 1. Уровень сероконверсий антигемагглютининовых антител у серонегативных лиц (63 чел.) составил 65,6% при этом у лиц с начальным титром антител менее 1:10 (40 чел.) наблюдали 70% сероконверсий.

Использование предлагаемого способа позволяет получить неизвестный ранее продукт очищенную живую гриппозную вакцину. Любые известные ранее живые вакцины, в том числе получаемая наиболее близким способом к предлагаемому (авт.свид. СССР N 1125815), были неочищенными. Степень очистки характеризуется данными приведенных выше примеров и таблиц.

Достигнутая степень очищенности вакцины имеет следствием: повышение ее иммуногенности; снижение аллергизирующего действия.

Повышение уровня иммуногенной активности вакцины проиллюстрировано по сравнению с авт.св. СССР N 174327 данными примеров 1, 3, 4. По сравнению с авт.св. СССР N 1125815 наиболее близким по техническому решению предлагаемому изобретению, прямого сравнения в эксперименте не проводили, поскольку нет разрешения органов здравоохранения на изготовление прототипной вакцины, в том числе для сравнительных испытаний. Тем не менее, можно заключить, что по отношению к сравниваемому способу также достигнуто повышение иммунологической активности, т.к. испытания проведены на маленьких детях, которые встретились с вирусом гриппа впервые, в связи с чем их процент сероконверсий должен быть повышенным. Предлагаемая вакцина испытана только на взрослых людях. При этом указанный в примерах 1, 3, 4 процент сероконверсий от 61 до 100% значимо (при р= 0,05) не отличается от 93,2% сероконверсий, указанных в описании прототипа способа сравнения.

Однако новую вакцину вводят однократно, тогда как известные живые гриппозные вакцины двукратно, что и свидетельствует о достижении нового данного вида положительного эффекта.

Данные о снижении аллергизирующих свойств вакцины, обусловленные очисткой от овальбумина приведены в примере 1.

Использование: медицина, в частности технология получения очищенной живой гриппозной вакцины. Сущность: предлагаемый способ предусматривает осветление вируссодержащей жидкости куриных эмбрионов (индекс инфекционность/ гемагглютинин ≅ 7) с последующей очисткой, стабилизацией и лиофилизацией вируса. Очистку инфекционного вируса гриппа производят ультрацентрифугированием в градиенте плотности сахарозы или микрофильтрацией. 1 з.п. ф-лы, 3 табл.

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЖИВОЙ ГРИППОЗНОЙ ВАКЦИНЫ, включающий культивирование вируса гриппа в развивающихся куриных эмбрионах, отделение вируссодержащей аллантоисной жидкости, осветление, стабилизацию и лиофилизацию вирусного концентрата в присутствии протектора, отличающийся тем, что перед осветлением проводят определение белка в аллантоисной жидкости, для осветления используют аллантоисную жидкость с индексом инфекционная активность/гемагглютинирующая активность ≥ 7, перед стабилизацией дополнительно проводят очистку вируса ультрацентрифугированием в градиенте плотности сахарозы или микрофильтрацией, стабилизацию проводят путем разведения вируса в соотношении 1 5,6 гидролизином, содержащим 0,02% сывороточного альбумина человека, а лиофилизацию проводят, используя в качестве протектора желатиноль и D-сорбит, взятые по 2,5 мас. каждого. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что при содержании белка в аллантоисной жидкости, равном или большем 0,3 мг/мл, микрофильтрацию проводят в режиме диафильтрации с последующей микрофильтрацией и диафильтрацией вирусного концентрата.