СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЦЕНТРАТА ВИРУСА ГРИППА ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ВАКЦИНЫ Российский патент 2025 года по МПК A61K39/145 

Область техники

Заявленное изобретение относится к области фармацевтических препаратов и может быть использовано для производства вакцин против гриппа.

Описание предшествующего уровня техники

В настоящее время широкое распространение получили два типа противогриппозных вакцин: инактивированные (расщепленные, субъединичные, виросомальные) и живые аттенуированные противогриппозные вакцины. Производство вакцин против сезонного гриппа основано на культивировании вируса в курином эмбрионе или клеточных культурах. ВОЗ ежегодно обновляет состав противогриппозных вакцин на основе информации, которую предоставляет Глобальная система по эпиднадзору за гриппом и ответным мерам (ГСЭГО). Поскольку производство вакцины занимает около 6 месяцев, ежегодно вакцина против гриппа производится в условиях большого дефицита времени. Для того чтобы произвести любой вариант противогриппозных вакцин с использованием куриных эмбрионов, необходимо сначала получить достаточное количество концентрата вируса гриппа. Следует отметить, что реассортанты вируса гриппа, подготавливаемые сотрудничающими центрами ВОЗ и используемые для культивирования вируса гриппа, обладают разной продуктивностью, что влияет на технологию получения концентрата вируса. В связи с этим задача, на решение которой направлено настоящее изобретение, заключается в разработке технологии получения концентратов вируса гриппа, которая позволит произвести достаточное количество концентратов вируса гриппа соответствующего качества для производства вакцины за короткое время.

В патенте RU 2740751 от 20.01.2021 описан способ получения концентрата вируса гриппа, включает в себя культивирование вирусов гриппа в развивающихся куриных эмбрионах, очистку собранной вируссодержащей аллантоисной жидкости (ВАЖ) с использованием микрофильтрации через каскад фильтрующих элементов с размерами пор соответственно: 2,3; 1,6; 1,2; 0,8; 0,44 мкм, концентрирование на установке для ультрафильтрации в тангенциальном потоке с 4 кассетными модулями с размером пор 300 кДа, очистку вирусных частиц ультрацентрифугированием в градиенте плотности при помощи двух растворов сахарозы 50% и 20% при скорости вращения ротора 30000 об/мин и гель-хроматографией на полимерном носителе. Предложенный способ не может обеспечить высокую эффективность технологии получения вирусного концентрата по причине потерь гемагглютинина за счет сорбции на всей площади фильтрации дебрисных культур различных размеров, которые получаются в результате размножения вируса гриппа и разрушения клеток куриных эмбрионов и могут содержать гемагглютинин. Несмотря на то, что до проведения процесса микрофильтрации предлагается добавление равного объему ВАЖ количества фосфатного буферного раствора, что также увеличивает расход сырья и время процесса очистки ВАЖ, в предлагаемом способе отсутствует стадия диафильтрации. При этом гель-хроматография на полимерном носителе также уменьшает выход гемагглютинина в вирусном концентрате. Аналогичную очистку ВАЖ с использованием микрофильтрации через каскады фильтрующих элементов с различными размерами пор описывают в патенте RU 2741003 от 22.01.2021, где предварительную очистку ВАЖ от дебрисных структур проводят методом трехступенчатой микрофильтрации с диаметрами пор 10 мкм, 1,2 мкм и 0,6 мкм, причем процесс предварительной дезагрегации и последующей диафильтрации не описан. В патенте RU 2535153 от 10.12.2014 раскрыто, что микрофильтрацию проводят на 2 каскадах картриджей (диаметр пор 10 мкм и 1 мкм) без последующей диафильтрации, однако используют предварительную очистку с использованием полиэтиленгликоля с молекулярной массой 6000 в конечной концентрации 1,5%. Однако недостатком такого способа является увеличение времени технологического процесса на 17 ч.

Способ очистки ВАЖ, описанный в патенте RU 2493872 от 27.09.2013, предусматривает центрифугирование (1000-1500 g) ВАЖ до этапа фильтрации через полипропиленовое волокно. Однако микрофильтрацию ВАЖ проводят на фильтрующих элементах 0,1-0,2 мкм с дальнейшей диафильтрацией фосфатным буферным раствором, содержащим 0,25-0,5 М натрия хлорида, ЭДТА или цитрат натрия, концентрирование вируса гриппа на мембранах с порогом отсечения 300-500 кДа с последующей диафильтрацией фосфатным буферным раствором, содержащим 0,25-0,5 М натрия хлорида, ЭДТА или цитрат натрия, 0,02-0,002% анионного детергента. Недостатками данного способа являются: отсутствует этап дезагрегации и недостаточная центробежная сила, которая не позволит убрать дебрис размером до 1 мкм, а соответственно, произойдет сорбция на фильтрующих элементах с неоптимально маленьким размером пор 0,1-0,2 мкм.

Наиболее близкими прототипами изобретения являются способы получения концентратов вируса гриппа, описанных в патенте RU 2754398 от 01.09.2021 и RU 2710239 от 25.12.2019.

В патенте RU 2754398 (ООО «Форт») раскрыт способ получения концентратов антигенов вируса гриппа, который включает подготовку посевного материала, культивирование вируса гриппа в развивающихся 10-12-дневных куриных эмбрионах до достижения заданной инфекционной активности, сбор вируссодержащей жидкости и её инактивацию в присутствии бетапропилактона в конечной концентрации не более 0,1% по объему, очистку вируса методом микро- и ультрафильтрации тангенциальным методом, выделение вируса ультрацентрифугированием в сахарозном градиенте при 90000-100000 g.

В указанном способе не описывается метод установления оптимальных условий культивирования вируса гриппа, и отсутствуют методы повышения продуктивности посевного материала при заражении куриных эмбрионов. Также не установлено время охлаждения куриных эмбрионов перед сбором ВАЖ, которое влияет на дальнейшие потери гемагглютинина при очистке. Недостатками предложенного способа очистки ВАЖ является отсутствие этапа дезагрегации, которая необходима для предотвращения появления агрегатов из дебриса, которые могут содержать частицы вируса гриппа, которые в свою очередь могут уйти на этапе сепарирования. Отсутствует информация о размерах пор микрофильтрации, где при неоптимальном выборе размеров пор возможны потери гемагглютинина.

В патенте RU 2710239 (ФГУП СПбНИИВС ФМБА России) перед этапом очистки ВАЖ проводят дезагрегацию вирусов хлористым натрием в конечной концентрации 0,23-0,30 М, инактивацию вирусной активности с использованием β-пропиолактона, очистку ВАЖ методами микрофильтрации с использованием каскада из трех фильтров с диаметром пор 10 мкм, 1 мкм, 0,6 мкм и ультрафильтрации с пределом отсечения 300 кДа, последующее очищение - путем двойного ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы. Так же, как и в предыдущем прототипе, отсутствует описание способов повышения продуктивности посевного материала при заражении куриных эмбрионов. Недостатками предложенного способа очистки ВАЖ являются потери гемагглютинина на этапе микрофильтрации за счет наличия большой площади фильтрации, а также отсутствие этапа диафильтрации. В результате длительных экспериментальных работ, проведенных авторами этого изобретения, было установлено, что полного отделения дебриса от вирионов гриппа не удается достичь при любой комбинации фильтров.

Ни в одном из рассматриваемых документов не описан способ получения концентрата вируса гриппа с оптимальными условиями заражения и инкубирования куриных эмбрионов и с повышением продуктивности посевных материалов при заражении вирусом гриппа. Также не рассматривался вопрос по максимальному снижению технологических потерь при получении инактивированных вирусных концентратов для производства гриппозных вакцин. На решение этих задач и были направлены исследования по разработке универсальной технологии получения вирусных концентратов, которая позволит произвести достаточное количество вирусных концентратов соответствующего качества для производства вакцины за короткое время, с наибольшим выходом активного и эффективного концентрата вируса гриппа.

Описание фигур

На Фиг. 1 представлена графическая зависимость концентрации гемагглютинина (ГА) в ВАЖ (мкг/мл) от влияния факторов времени и температуры инкубирования.

На Фиг. 2 приведена графическая зависимость концентрации ГА в ВАЖ (мкг/мл) от влияния факторов количества гидрокортизона и времени инкубирования.

На Фиг. 3 представлен график зависимости температуры ВАЖ в куриных эмбрионах от времени охлаждения в холодильной камере.

На Фиг. 4 представлена зависимость изменения мутности ВАЖ от концентрации хлорида натрия.

На Фиг. 5 приведены показатели качества фракций концентрата вируса гриппа B/Phuket/3073/2013, полученного по примеру 1.

На Фиг. 6 приведены показатели качества фракций концентрата вируса гриппа B/Phuket/3073/2013, полученного по примеру 2.

Описание изобретения

Настоящее изобретение предлагает способ получения концентрата вируса гриппа, включающий:

- выбор реассортанта для производства гриппозной вакцины;

- подбор оптимальных условий для проведения инкубирования для каждого штамма, таких как температура и продолжительность, при этом температура выбирается в пределах 34±2°С, а продолжительность - в пределах 35-72 ч;

- заражение 11±1-дневных куриных эмбрионов вирусным материалом, содержащим добавки гидрокортизона в концентрации 4-16 мкг/КЭ или не содержащим этой добавки, и антибиотика в концентрации 40-60 мкг/мл;

- инкубирование при влажности 60±5% при подобранных для каждого штамма условиях;

- охлаждение куриных эмбрионов при температуре 5±3°С в течение не менее 8 ч;

- сбор вируссодержащей аллантоисной жидкости (ВАЖ) с последующей дезагрегацией электролитами;

- осветление ВАЖ;

-микрофильтрация полученной осветленной ВАЖ;

- очистка полученного раствора;

- инактивация раствора β-пропиолактоном до конечной концентрации 0,1% на этапе концентрированного ВАЖ, очищенного вирусного концентрата или до этапа осветления ВАЖ;

- получение концентрата вируса гриппа для производства гриппозной вакцины.

При этом на стадии заражения в качестве антибиотика можно использовать различные антибиотики, например, канамицин, амикацин, амоксициллин, цефуроксим и другие, предпочтительно используют гентамицин.

Также способ предполагает, что на стадии сбора вируссодержащей аллантоисной жидкости (ВАЖ) с последующей дезагрегацией электролитами в качестве электролита используются сильные электролиты, например, хлористый натрий в конечной концентрации 0,2-0,3 М, хлористый калий, хлорид кальция и другие.

В некоторых вариантах реализации способа согласно изобретению микрофильтрацию проводят на фильтрах с размером пор не менее 0,6 мкм, например, с размером пор 0,6 мкм.

В способе согласно изобретению можно использовать типы вирусов гриппа А и В, например, подтипы A (H1N1), A (H3N2), линии В - B/Yamagata, B/Victoria. Также после получения как описано выше данный полученный концентрат вируса гриппа, без предварительного расщепления можно использовать в качестве антигена противогриппозной вакцины.

Также, согласно изобретению, предложена противогриппозная вакцина, полученная с использованием концентрата вируса гриппа, полученного описанным способом. Указанная вакцина может быть получена из одного, трех или четырех концентратов антигенов вируса гриппа, и может включать концентраты антигенов вируса гриппа типов А или В.

Также предложено применение концентрата вируса гриппа, полученного способом согласно изобретению, для производства гриппозной вакцины.

Техническим результатом изобретения является концентрат вируса гриппа, полученный способом с оптимальными условиями и повышенной продуктивностью, при меньших временных затратах, при этом концентрат вируса гриппа обладает высокой эффективностью.

В результате длительных экспериментальных работ, проведенных авторами этого изобретения, было установлено, что именно способ согласно изобретению позволяет получить концентрат, наиболее эффективный для производства вакцины. Технический результат достигается за счет реализации способа, включающего следующие стадии:

- выбор реассортанта для производства гриппозной вакцины;

- подбор условий инкубирования, таких как температура в пределах 34±2°С, и продолжительность - в пределах 35-72 ч;

- заражение 11±1-дневных куриных эмбрионов вирусным материалом, содержащим добавки гидрокортизона в концентрации 4-16 мкг/КЭ или не содержащим этой добавки, и антибиотика в концентрации 40-60 мкг/мл;

- инкубирование при влажности 60±5% в зависимости от условий, подобранных для каждого штамма;

- охлаждение куриных эмбрионов при температуре 5±3°С в течение не менее 8 ч;

- сбор вируссодержащей аллантоисной жидкости (ВАЖ) с последующей дезагрегацией электролитами;

- осветление ВАЖ;

-микрофильтрация полученной осветленной ВАЖ;

- очистка полученного раствора;

- инактивация раствора β-пропиолактоном до конечной концентрации 0,1% на этапе концентрированного ВАЖ, очищенного вирусного концентрата или до этапа осветления ВАЖ;

- получение концентрата вируса гриппа для производства гриппозной вакцины.

Авторы настоящего изобретения установили, что введение гидрокортизона и антибиотика в вирусный материал при заражении 11±1 дневных куриных эмбрионов позволяет существенно повысить выход и чистоту получаемого концентрата вируса гриппа. В частности, при исследовании возможных концентраций, влияющих на получение эффективного концентрата вируса гриппа, было установлено, что наибольшая концентрация вируса в концентрате достигается при введении гидрокортизона в концентрации 4-16 мкг/КЭ и антибиотика гентамицина в концентрации 40-60 мкг/мл на КЭ или на мл вирусного материала, используемого при заражении опция.

Кроме того, было установлено, что инкубирование именно при температуре 34±2°С в течение 35-72 ч и охлаждание куриных эмбрионов при температуре 5±3°С в течение не менее 8 ч позволяет достичь максимальной плотности (концентрации) антигена в ВАЖ.

Заявляемый способ получения концентрата вируса гриппа состоит из нескольких этапов, выполнение которых позволяет существенно сократить технологические потери и повысить качество получаемого концентрата вируса гриппа (повысить эффективность), что в свою очередь позволит сократить время наработки концентратов вируса гриппа для производства гриппозной вакцины.

Выбор наиболее продуктивного реассортанта заключается в заражении не менее 36 10-12-дневных куриных эмбрионов (КЭ) каждым рекомендованным ВОЗ реассортантом, инкубировании при температуре 34±2°С, в течение 35-50 ч для типа А и 50-72 ч для типа В, затем сборе ВАЖ и объединение образцов в пулы (не менее 6 пулов) и оценке в полученных пулах титра гемагглютинации и концентрации гемагглютинина (ГА) методом одиночной радиальной иммунодиффузии (ОРИД) или методом ОФ-ВЭЖХ или количества вирусных частиц методом количественного ПЦР. Выбирается тот реассортант, который дает максимальные значения ГА и титра ГА. Пример полученных результатов выбора наиболее продуктивного реассортанта штамма A/Victoria/2570/2019 (H1N1) отражен в таблице 1.

Подбор более точных условий культивирования аналогичен и заключается в заражении по не менее 36 куриных эмбрионов (КЭ) 10-12-дневных вирусом гриппа выбранного реассортанта, инкубировании при различных температурах в диапазоне 34±2°С в течение различного времени в диапазоне от 35 до 72 ч, затем сборе ВАЖ и объединении образцов в пулы (не менее 6 пулов) и оценке в полученных пулах титра гемагглютинации и концентрации гемагглютинина (ГА) методом одиночной радиальной иммунодиффузии (ОРИД) или методом ОФ-ВЭЖХ или количества вирусных частиц методом количественного ПЦР. Пример полученных результатов подбора условий культивирования вируса гриппа B/Phuket/3073/2013 отражен на Фиг. 1. Представленная зависимость показывает, что оптимальная точка наработки гемагглютинина составляет 33°С в течение 65 ч.

Заражение 11±1 дневных куриных эмбрионов вирусным материалом (0,2 мл), содержащим добавку гидрокортизона в концентрации 4-16 мкг/КЭ увеличивало выработку гемагглютинина до 70% при оптимально подобранных условиях культивирования. Результат математической обработки, в программном приложении MINITAB на основе регрессионного и дисперсионного анализа, показал зависимость выхода гемагглютинина от концентрации гидрокортизона и времени инкубирования на примере вируса гриппа B/Phuket/3073/2013. Данная зависимость показана на Фиг. 2, как видно, она является достаточно комплексной и нелинейной.

Охлаждение куриных эмбрионов в холодильной камере при температуре 5±3°С не менее 8 ч необходимо для достижения температуры ВАЖ в яйце не более 6°С (показано на Фиг. 3), при которой происходит оптимальный сбор ВАЖ с дальнейшими минимальными потерями при очистке. Пример сокращения потерь за счет снижения температуры ВАЖ при сборе отражен в таблице 2.

Таблица 2 - Потери гемагглютинина в процессе очистки ВАЖ в зависимости от времени охлаждения куриных эмбрионов в холодильной камере перед сбором Время охлаждения куриных эмбрионов перед сбором ВАЖ, ч Средние потери гемагглютинина в процессе очистки ВАЖ, % Вирус гриппа типа А Вирус гриппа типа В 2 29±6 39±6 4 27±6 33±5 6 18±3 21±3 8 15±2 17±3

Как видно из данных, именно при выдерживании не менее 8 ч в холодильной камере позволяет достичь наименьших потерь гемагглютинина в процессе очистки ВАЖ. Введение стадии дезагрегации перед очисткой ВАЖ также необходимо для сокращения потерь вируса гриппа на последующих этапах очистки. На Фиг. 4 представлена зависимость изменения мутности ВАЖ от концентрации вносимого хлорида натрия. Мутность ВАЖ определяли нефелометрическим методом на мутномере HACH 2100Q.

При осветлении ВАЖ методами микрофильтрации возможны высокие потери вируса гриппа, которые возникают из-за сорбции на фильтрах, имеющих огромную общую площадь фильтрации. Причем, для снижения этих потерь часто используют принцип каскада фильтров, что еще больше увеличивает общую площадь фильтрации, тем самым даже для оптимально подобранных материалов фильтров общие потери вируса гриппа являются ощутимыми. Альтернативным методом очистки, который дает меньше потерь, сохранив ту же степень очистки, является сепарирование. Сепаратор позволяет провести очистку ВАЖ от крупных преципитатов дебрисных белков и эритроцитов (с размером более 1 мкм), что снижает потери гемагглютинина, которые возникают из-за сорбции в процессе микрофильтрации. Результаты сравнения технологии очистки ВАЖ с использованием каскада глубинных фильтров с диаметром пор 10 мкм, 1 мкм (материал фильтров - полипропилен) и с использованием сепаратор «Clara - 20» представлены в таблице 3.

Таблица 3 - Оценка эффективности технологии при использовании сепаратора Штамм вируса гриппа Очистка ВАЖ с использованием сепаратора Очистка ВАЖ с использованием глубинных фильтров
(10 мкм и 1 мкм) Средние потери ГА, % Медиана потерь ГА Средние потери ГА, % Медиана потерь ГА B/Washington/
02/2019 16,5 19,0 39,8 38,8 A/HongKong/
2671/2019(H3N2) 18,5 18,3 21,0 18,9 A/Guangdong-Maonan/
SWL1536/2019 (H1N1) 20,0 20,0 28,7 28,7

Как следует из данных Таблицы 3, использование сепарирования позволяет снизить потери гемагглютинина в среднем на 10-20% в зависимости от штамма.

Однако при использовании сепаратора существует риск вспенивания материала, что может влиять на увеличение потерь на следующих технологических этапах. Поэтому в предлагаемом способе получения концентратов антигенов вируса гриппа включена стадия дегазации, которая может проводиться с применением проточного ультразвукового реактора или с последующим удалением пены методом перекачивания и отстаивания ВАЖ в промежуточную емкость. Результаты проведенных сравнительных испытаний представлены в таблице 4.

Таблица 4 - Оценка эффективности технологии получения концентратов вируса гриппа при использовании этапа дегазации после этапа сепарирования и этапа диафильтрации после этапа концентрирования Штамм вируса гриппа Средние потери ГА, % Очистка ВАЖ с использованием сепаратора Очистка ВАЖ с использованием сепаратора+дегазации ультразвуком+диафильтрации B/Washington/
02/2019 24±5 9±3 A/Victoria/2570/2019 (H1N1) 24±5 13±3 A/Tasmania/503/2020 (H3N2) 32±6 23±4

Для уменьшения технологических потерь на этапе концентрирования ультрафильтрацией (предел отсечения не менее 300 кДа, не более 1МДа) в предлагаемом способе применяется диафильтрация буферным раствором в количестве не менее пяти объемов концентрата. Результаты проведенных сравнительных испытаний представлены в таблице 4.

Как следует из данных Таблицы 4, использование сепарирования в сочетании с дегазацией позволяет снизить потери гемагглютинина в среднем на 10% в зависимости от штамма.

Ниже приведены примеры реализации изобретения. Примеры предназначены в качестве иллюстративных и не имеют цели ограничения настоящего изобретения в какой-либо мере.

Примеры

Пример 1

Получение вирусного концентрата вируса гриппа

Для получения концентрата вируса гриппа B/Phuket/3073/2013 выбрали наиболее продуктивный реассортант. Для этого провели заражение одиннадцатисуточных куриных эмбрионов (КЭ) в количестве 36 штук диким типом B/Phuket/3073/2013 (NIBSC, UK), в количестве 36 штук реассортантом BVR 1B (VIDRL, Australia) и в количестве 36 штук реассортантом NYMC BX-59B B/California/12/2015 (NIBSC, UK). Далее проводили инкубирование при температуре 33°С, в течение 63 ч, затем собрали ВАЖ и объединили образцы в пулы по 6 КЭ. Провели оценку титра гемагглютинации и концентрации гемагглютинина (ГА) методом одиночной радиальной иммунодиффузии (ОРИД). Таблица 5. - Подбор наиболее продуктивного штамма/реассортанта B/Phuket/3073/2013.

Результаты представлены в таблице 5.

Таблица 5 - Подбор наиболее продуктивного штамма/реассортанта B/Phuket/3073/2013 Штамм Реассортант Температура инкубирования, °С Время инкубирования, ч Титр РГА Концентрация ГА, мкгГА/мл Среднее значение ГА (доверительный интервал для р=0,95) B/Phuket/3073/2013 Дикий штамм 33,0 63 1:320 16,6 16,5±0,8 1:320 15,8 1:640 17,5 1:640 15,8 1:640 16,0 1:640 17,2 B/Phuket/3073/2013 BVR-1B 33,0 63 1:640 15,1 16,9±1,2 1:640 16,6 1:640 17,1 1:640 17,0 1:640 16,8 1:640 18,8 B/California/12/2015 NYMC BX-59B 33,0 63 1:320 13,9 14,9±0,6 1:320 15,1 1:320 15,6 1:320 14,9 1:320 14,8 1:320 15,3

Далее были выбраны условия культивирования для дикого типа B/Phuket/3073/2013 (NIBSC, UK), для этого провели заражение и инкубирование одиннадцати суточных куриных эмбрионов в соответствии со схемой, представленной в таблице 6.

Таблица 6 - Схема оценки оптимальных условий инкубирования после заражения куриных эмбрионов вирусом гриппа B/Phuket/3073/2013 № образца для контроля титра и содержания ГА Количество КЭ, пошедших в образец/Количество образцов Время инкубирования, ч Температура инкубирования, °С 1.1-1.6 6/6 55 32 2.1-2.6 6/6 65 3.1-3.6 6/6 72 4.1-4.6 6/6 55 33 5.1-5.6 6/6 65 6.1-6.6 6/6 72 7.1-7.6 6/6 55 34 8.1-8.6 6/6 65 9.1-9.6 6/6 72

Результаты оценки титра гемагглютинации и концентрации ГА методом ОРИД представлены на Фиг. 2.

Таким образом, оптимальными условиями для дикого типа B/Phuket/3073/2013 (NIBSC, UK) являются температура инкубирования 33°С и время 65 ч.

Для получения ВАЖ 70000 шт. 11-суточных КЭ были инфицированы дозой рабочего раствора посевного вируса дикого типа B/Phuket/3073/2013 (NIBSC, UK), имеющей инфекционный титр 10^3,33ЭИД₅₀/0,2 мл и содержащей добавку гидрокортизона в концентрации 50 мкг/мл. Инкубацию после заражения проводили при температуре 33°С в течение 61-65 ч. Охлаждение КЭ после инкубации проводили в холодной камере при температуре 5±3°С в течение 10-14 ч. После охлаждения ВАЖ собирали в реактор в объеме 728 л. Далее в реактор с собранной ВАЖ для дезагрегации было добавлено 74 л 2,5 М раствора NaCl, с последующим перемешиванием. Выход гемагглютинина на этой стадии технологического процесса составил 247 мкг ГА/КЭ.

После обработки ВАЖ из реактора подали на сепаратор Alfa Laval Clara - 20, скорость вращения ротора - 9200 об/мин (11000 g), скорость протока жидкости от 5 до 6 л/мин при противодавлении 2,0±0,2 атм. Далее ВАЖ подавали через ультразвуковой проточный реактор со скоростью потока сепаратора на микрофильтрацию с размером пор 0,6 мкм (материал фильтров - полипропилен, площадь фильтрации - 23,7 м²). Затем ВАЖ подавали на установку ультрафильтрации с кассетными модулями Pellicon 2 Biomax-300 с пределом отсечения 300 кДа (материал) для дальнейшей очистки и концентрирования. Полученный объем осветленной концентрированной ВАЖ составил 40 л. Далее провели диафильтрацию полученного концентрата 400 л фосфатно-буферного раствора (pH=7,4±0,2) с повторным концентрированием до 40 л.

Выход гемагглютинина на этой стадии технологического процесса составил 210 мкг ГА/КЭ.

Далее провели инактивацию вируса гриппа в течение 12 ч химическим способом, добавив 40 мл β-пропиолактона.

Затем провели очистку и концентрирование антигена вируса гриппа в градиенте плотности сахарозы. Для этого в ротор ультрацентрифуги загрузили трис-буфер (рН=7,4±0,2) и 60% раствор сахарозы. Растворы использовали охлажденными до температуры 5±3°С. После разгона до g=(85000±5000) м/с² в ротор центрифуги с помощью перистальтического насоса подали осветленную концентрированную ВАЖ. По окончании прохождения всего объема концентрированной ВАЖ в ротор ультрацентрифуги подали трис-буфер и провели изоплотностное центрифугирование.

После окончания изоплотностного центрифугирования провели разгрузку полученных фракций вирусного концентрата (ВК). Собрали 20 фракций содержащегося в роторе градиента плотности сахарозы: первые две фракции, объемом по 200 мл, последующие - по 100 мл. Из градиента для дальнейшей работы были отобраны 800 мл (8 фракций) с оптимальной концентрацией сахарозы не более 50% и титром ГА не менее 1:16000. Качество полученного концентрата вируса гриппа представлено на Фиг. 5.

Выход гемагглютинина на этой стадии технологического процесса составил 197 мкг ГА/КЭ. Общие потери гемагглютинина при получении концентрата вируса гриппа составили не более 20,2%.

В этом объеме вирусного концентрата содержалось 39,8 г белка (определение проводили методом Бредфорда) и 13,8 г ГА (определение проводили методом ОРИД).

Пример 2

Получение вирусного концентрата согласно способу предшествующего уровня техники

За прототип был принят способ, описанный в патенте RU 2710239.

Для получения ВАЖ 70000 штук 11-суточных КЭ были инфицированы дозой рабочего раствора посевного вируса NYMC BX-59B B/California/12/2015, имеющей инфекционный титр 10^3,66ЭИД₅₀/0,2 мл. Инкубация после заражения проводилась при температуре 35°С в течение 48-52 ч. Охлаждение КЭ после инкубации проводили в холодной камере при температуре 5±3°С в течение 4-8 ч. После охлаждения ВАЖ была собрана в реактор в объеме 687 л. Далее в реактор с собранной ВАЖ для дезагрегации добавили 70 л 2,5 М раствора NaCl, с последующим перемешиванием, после чего добавили 0,68 л β-пропиолактона. Инактивацию проводили при температуре 6±2°С в течение 10 ч. Выход гемагглютинина на этой стадии технологического процесса составил 171 мкг ГА/КЭ.

Далее после очистки и концентрирования ВАЖ с помощью микро- и ультрафильтрации было получено 40 л концентрата ВАЖ. Выход гемагглютинина на этой стадии технологического процесса составил 104 мкг ГА/КЭ.

Затем провели очистку и концентрирование антигена вируса гриппа в градиенте плотности сахарозы. После окончания изоплотностного центрифугирования провели разгрузку полученных фракций вирусного концентрата (ВК). Собрали 20 фракций содержащегося в роторе градиента плотности сахарозы: первые две фракции, объемом по 200 мл, последующие - по 100 мл. Из градиента для дальнейшей работы были отобраны 800 мл (8 фракций) с оптимальной концентрацией сахарозы не более 50% и титром ГА не менее 1:16000. Качество полученного концентрата вируса гриппа представлено на Фиг. 6.

Выход гемагглютинина на этой стадии технологического процесса составил 99 мкг ГА/КЭ. Общие потери гемагглютинина при получении концентрата вируса гриппа составили около 42,1%.

В этом объеме концентрата вируса гриппа содержалось 21,2 г белка (определение проводили методом Бредфорда) и 6,9 г ГА (определение проводили методом ОРИД).

Как видно из данных, представленных на Фиг. 1 и 2, способ согласно изобретению позволяет получить концентраты вируса гриппа с повышенным выходом и чистотой.

Изобретение относится к биотехнологии. Описан способ получения концентрата вируса гриппа, включает выбор реассортанта, подбор оптимальных условий для проведения инкубирования, в частности температуры и продолжительности, заражение 11±1-дневных куриных эмбрионов вирусным материалом, содержащим добавки гидрокортизона и антибиотика, инкубирование, охлаждение куриных эмбрионов, сбор вируссодержащей аллантоисной жидкости (ВАЖ) с последующей дезагрегацией электролитами, осветление ВАЖ, микрофильтрацию полученной осветленной ВАЖ, очистку полученного раствора, инактивацию очищенного вирусного концентрата или до этапа осветления ВАЖ и получение концентрата вируса гриппа. Изобретение расширяет арсенал способов получения концентрата вируса гриппа. 4 з.п. ф-лы, 6 ил., 6 табл., 2 пр.

1. Способ получения концентрата вируса гриппа, включающий:

- выбор реассортанта для производства гриппозной вакцины;

- подбор условий инкубирования, таких как температура в пределах 34±2°С и продолжительность в пределах 35-72 ч;

- заражение 11±1-дневных куриных эмбрионов вирусным материалом, содержащим антибиотик в концентрации 40-60 мкг/мл;

- инкубирование при влажности 60±5% в зависимости от условий, подобранных для каждого штамма;

- охлаждение куриных эмбрионов при температуре 5±3°С в течение не менее 8 ч;

- сбор вируссодержащей аллантоисной жидкости (ВАЖ) с последующей дезагрегацией электролитами;

- осветление ВАЖ с использованием сепаратора с последующей дегазацией;

- микрофильтрация полученной осветленной ВАЖ;

- очистка полученного раствора;

- инактивация раствора β-пропиолактоном до конечной концентрации 0,1% на этапе концентрированного ВАЖ, очищенного вирусного концентрата или до этапа осветления ВАЖ;

- получение концентрата вируса гриппа для производства гриппозной вакцины.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что на стадии заражения в качестве антибиотика используют гентамицин.

3. Способ по п. 1, в котором на стадии заражения эмбрионов дополнительно вносят добавку гидрокортизона в концентрации 4-16 мкг/КЭ.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что на стадии сбора вируссодержащей аллантоисной жидкости (ВАЖ) с последующей дезагрегацией электролитами в качестве электролита используется хлористый натрий в конечной концентрации 0,2-0,3 М.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что микрофильтрацию проводят на фильтрах с размером пор 0,6 мкм.