Штамм бактерий РSеUDомоNаS рUтIDа - 106 - деструктор диметилфенилкарбинола и фенола Советский патент 1992 года по МПК C02F3/34 C12N1/20 

Изобретение относится к прикладной микробиологии и биотехнологии и может быть использовано для очистки сточных вод от диметилфенилкарбинола и фенола.

Диметилфенилкарбинол (ДМФК) входит в состав сточных вод производства фенола и ацетона кумольным способом. Он получается как побочный продукт при распаде гидроперекиси изопропилбензола и концентрируется при отгонке фенола-сырца. Его содержание в сточных водах может резко увеличиваться при применении физико- химических методов обработки сточных вод, основанных на восстановлении гидроперекиси изопропилбензола, Диметилфенилкарбинол также образуется как промежуточный продукт при промышленном процессе получения а -метилстирола путем непрямого дегидрирования, изопропилбензола. Диметилфенилкарбинол является достаточно токсичным загрязнителем окружающей среды, предельно допустимая концентрация его в воде водоемов составляет 0,05 мг/л.

Фенол входит в состав сточных вод производства фенолформальдегидных смол, нитро- и хлорфенолов, фенолсульфокислот, капролактама, салициловой, пикриновой кислот и других ароматических соединений, его предельно допустимая концентрация в воде составляет 0,001 мг/л.

По данным литературы штаммы микроорганизмов, способные утилизировать фенол, известны. Например, французские исследователи селектировали среди представителей рода нокардия штамм Nocardia sp. B87, способный разрушать фенол в концентрации до 2000 мг/л, однако процесс деструкции требовал обязательного присутствия в среде дополнительного -сточника азота и углерода.

Штамм Pseudomonas putida C3-173 способен помимо фенола (300 мг/л за 8 ч при 30°С) утилизировать неионогеннs4 поверхностно-активные вещества, но осу- ществляет все эти процессы при культивировании на полноценной питательной среде.

СП

С

sg КЛ

vO

XI

«С

Јь

Штамм Pseudomonas QT 31 утилизирует 500 мг/л фенола за 47 ч, а культура дрожжей использовала только 200 мг/л в течение 24 ч. Поиск новых деструкторов фенола привел к обнаружению представителей рода Streptomyces - Streptomyces setonii, способного метаболировать его по орто-пути расщепления ароматических соединений при 45°С и Candida - Candida tropicales HP 15. Недостатками этих штаммов являлось отсутствие у них способности разрушать помимо фенола диметилфенилкарбинол, хотя многие промышленные сточные воды характеризуются наличием именно таких сочетаний загрязнителей.

Наиболее близким к предлагаемому штамму Rseudomonas aeruginosa № 228, разрушающий фенол на 99,3 - 99,6% за 24 ч при исходном содержании в среде культивирования 200-300 мг/л 1. Недостатком этого известного штамма-деструктора фенола является отсутствие у него способности разрушать диметилфенилкарбинол.

Целью изобретения является получения штамма бактерий, способного утилизиро- вать диметилфенилкарбинол, фенол при их совместном присутствии и сохраняющего свою деструктивную активность в сточных водах.

Предлагаемый штамм депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов ВНИИ Генетика под регистрационным номером ВКПМ-5249.

Предлагаемый штамм характеризуется следующими морфологическими и физиоло- го-биохимическими свойствами.

Морфологические признаки. Молодые клетки штамма - короткие, утолщенные на концах палочки (2-3 мм), расположенные беспорядочно одиночно или попарно. Гра- мотрицательные, спор и капсул не образует.

Культуральные свойства. На синтетический минеральной среде М 9 следующего состава, мг/л: Ма2НРСм 6000,0; КНаРСм 3000,0; NaC 500,0; NH4CI 1000,0, содержа- щей ароматические соединения в качестве единственного источника углерода, после 72 ч инкубирования при 30°С образует колонии диаметром 1-1,5 мм неправильной круглой формы, гладкие, блестящие, края ровные.

Физиоло го-биохимические свойства. Аэроб, подвижен, каталазо- и оксидазопо- ложителен, желатиназу, амилазу, фенилала- ниндезаминазу не образует. Образует аргининдигидролазу и уреазу. На среде Хью-Лейфсона образует кислоту из глюкозы, арабинозы, ксилозы,сахарозы и мальтозы. На среде Кинг-В образует лимонно-желтый водорастворимый флюоресцирующий пигмент. В качестве единственного источника углерода может использовать глюкозу, сукцинат, L-глутаминовую кислоту, ацетат.

Оптимальные условия культивирования на полноценных питательных средах рН 7,0+0,5, температура 30+1 °С.

Условия хранения. Стерильные столбики с 0,75% МПА засевают уколом, инкубируют при 30°С 72 ч, заливают 1 мл стерильного вазелинового масла и хранят при 4°С; пересевают 2 раза в год.

Чувствительность к антибактериальным препаратам. Штамм GFS 106 чувствителен к стрептомицину, мономицину, полимиксину, тетрациклину, рифампицину; устойчив к линкомицину, ристомицину, левомицетину, бензилпенициллину, олеандомицину, эритромицину, карбомицину.

Патогенные свойства. При внутри- брюшном заражении беспородных белых мышей (10 животных на пробу) взвесью суточной культуры штамма в концентрации 1 млрд. микробных тел/мл в объеме 0,5 мл на животное заболевания не обнаружено. Срок наблюдения 7 дней. Это дало основание считать культуру штамма непатогенной. На основании комплекса морфолого-культу- ральных и физиолого-биохимических свойств штамм был идентифицирован как Pseudomonas putida.

Пример 1. Получение штамма GFS- 106.

Штамм Pseudomonas putida GFS-106 был выделен из образца почвы, взятого на территории предприятия, производящего фенол и ацетон, методом прямого высева почвенной суспензии на агаризованную среду М9 следующего состава, мг/л: Na2HP04 6000,0; КН2Р04 3000,0; МЩС 1000,0; NaCI 500,0; диметилфенилкарбинол 500,0; агар-агар 1500; рН 7,0+0,2.

Выделенную культуру пассировали по плотным средам того же минерального состава, постепенно повышая содержание в ней диметилфенилкарбинола в качестве единственного источника углерода с 500 до 775 мг/л, отбирая наиболее крупные колонии.

На среде, содержащей в качестве единственного источника углерода 0,775 г/л диметилфенилкарбинола, роста данной культуры не наблюдалось. Клоны, отобранные с плотной синтетической минеральной среды М9 с содержанием диметилфенилкарбинола 0,75 г/л, проверяли на способность к утилизации этого субстрата при культивировании на жидкой среде того же состава в колбах на 250 мл, содержащих 100 мл среды. Изменение содержания диметилкарбинола в среде культивирования контролировалось спектрофотометриче- ски.

Таким образом, методом направленной селекции был получен штамм бактерий GFS-106, способный к утилизации диметилфенилкарбинола в концентрации 750 мг/л. Дальнейшие исследования показали, что в спектр деструктивной активности данного штамма входит также фенол (ДО 350 мг/л).

Пример 2. Использование штамма GFS-106 в качестве деструктора диметилфенилкарбинола в условиях периодического культивирования на круговой качалке.

Суточную культуру штамма GFS-106, выращенную на полноценной питательной среде, отмывали трехкратным центрифугирование при 6000 об/мин в 0,9%-ном рас- твоое хлористого натрия. 1 мл суспензии (109 клеток/мл) вносили в колбу на 250,0 мл, содержащую 100мл неагаризованной минеральной среды М9 (состав среды см. пример 1) и 750 мг/л диметилфенилкарбинола в качестве единственного источника углерода и энергии. Культивирование проводили на круговой качалке (110-135 об/мин) при температуре инкубации 28-30°С. Изменение концентрации диметилфенилкарбинола в среде культивирования контролировалось методом газовой хроматографии и спектрометрии (пик оптической плотности данного вещества 251 нм).

Через 96 ч культивирования описываемого штамма концентрация диметилфенилкарбинола в среде снизилась на 98,6% и составила 10 мг/л, что является пределом чувствительности методов определения.

Пример 3. Использование штамма GFS-106 в качестве деструктора диметилфенилкарбинола в условиях периодического культивирования в лабораторном ферментере.

Суспензию клеток штамма GFS-106 в 0,9%-ном растворе хлористого натрия, приготовленную аналогично примеру 2, в количестве 5 мл вносят в 600 мл синтетической минеральной среды М9 (состав среды см. пример 1), содержащей 750 мг/л диметилфенилкарбинола в качестве единственного источника углерода. Рабочий объем ферментера 0,75 л,скорость подачи воздуха 0,8 л/мин, частота вращения магнитной мешалки 500 об/мин, температура культивирования 30°С. Изменение содержания диметилфенилкарбинола в среде культивирования контролировали методом газовой хроматографии и спектрофотометрии.

Через 72 ч культивирования предлагаемого штамма в данных условиях содержание диметилфенилкарбинолз в среде культивирования снижалось на 98,6% и составляло 10 мг/л, что является пределом чувствительности методов определения.

Пример 4. Использование штамма

GFS-106 в качестве деструктора фенола в условиях периодического культивирования на круговой качалке.

Изменение процесса утилизации фено0 ла описываемым штаммом проводили по схеме, изложенной в примере 2 с тем отличием, что в качестве единственного источника углерода вместо диметилфенол- карбинола использовали фенол в концент5 рации 350 мг/л. Изменение содержания фенола в среде культивирования контролировали спектрометрически (пик оптической плотности субстрата 270 нм).

Через 96 ч культивирования штамма

0 указанных условиях содержание фенола в среде культивирования снижалось на 52%. Дальнейшей утилизации субстрата не происходило из-за накопления неидентифицированных метаболитов в среде культи5 вирования.

Пример 5. Использование штамма GFS-106, иммобилизованного включением в гель агара, в качестве деструктора фенола.

0Клетки предлагаемого штамма иммобилизовали включением в гранулы агара. Для этого суспензию бактериальных клеток смешивали с раствором агара и вносили в охлажденное вазелиновое масло.

5 Сформировавшиеся гранулы отмывали, 20,0 г биоканализатора (5-Ю6 клеток/г) помещали в 800 мл синтетической минеральной среды М9 (состав среды по примеру 1), содержащей 350,0 мг/л фенола в качестве

0 единственного источника углерода. Изменение содержания фенола в среде культивирования контролировали спектро- фотометрически и фотоколориметрически с помощью цветной реакции с 4-аминоанти5 пирином.

Через 48 ч культивирования штамма при указанных условиях фенол в среде культивирования данным.методом не определялся.

0 Таким образом, иммобилизация включением в гель агара позволяла бактериальным клеткам штамма осуществить утилизацию фенола в концентрации 350 мг/л полностью.

5 Примерб. Использование штамма GFS-106 в качестве деструктора диметилфенилкарбинола и фенола в сточных водах.

Изучение процессов утилизации диметилфенилкарбинола и фенола аналогичны примеру 2, с тем отличием, что в качестве

среды культивирования использовалась сточная вода производства фенола, содержащая диметилфенилкарбинол в концентрации 520 мг/л, фенол 32 мг/л, а также ацетон, ацетофенон, а-метилстирол, органические кислоты,

Через 72 ч культивирования ни один из указанных компонентов сточных вод в среде культивирования методом газовой хроматографии не определялся. Результаты испытания биодеструктивной активности предлагаемого штамма, а также штамма- прототипа приведены в таблице.

Штамм P. aeruginosa № 228 разрушает фенол в концентрации 200-300 мг/л в течение 24 ч, а описываемый штамм GFS 106 в иммобилизованном состоянии 350 мг/л в течение 48 ч.

Предлагаемый штамм, хотя и не превосходит прототип по деструктивной активности по отношению к фенолу, но способен утилизовать диметилфенилкарбинол в концентрации до 750 мг/л в течение

72-96 ч в зависимости от условий культивирования.

Испытания штамма в реальных промышленных сточных водах, содержащих фенол и диметилфенилкарбинол, показали его жизнеспособность. Наличие в сточных водах незначительного количества ацетона, ацето- фенола, ее -метилстирола, органических кислот не снижает биодеструктивной активности описываемого штамма бактерий.

Таким образом, штамм обладает высокой деструктивной активностью, прошел испытания в образцах реальных промышленных сточных вод и может быть рекомендован для локальной очистки сточных вод как от диметилфенилкарбинола или фенола по отдельности, так и от их совместного присутствия в сточных водах.

Формула изобретения

Штамм бактерий Pseudomonas putida ВКПМ В-5249 -деструктор диметилфенилкарбинола и фенола.

Применение: очистка сточных вод от диметилфенилкарбинола и фенола. Сущность: штамм бактерий Pseudomanas putiria ВКПМ, В - 5249 выделен из образца почвы, взятого на территории предприятия, производящего фенол и ацетон мотором прямого высева почвенной суспензии на агаризо- ванную питательную среду. Штамм может быть применен для локальной очистки сточных вод. 1 табл.