Способ определения активности продуктов метаболизма микроорганизмов Советский патент 1983 года по МПК A61K39/00 C12N1/00 

(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ПРОДУКТОВ МЕТАБОЛИЗМА МИКРООРГАНИЗМОВ

1

Изобретение относится к ветеринарной или медицинской микробиологии в частно- сти к способам определения токсичности экзотоксинов патогенных микроорганиамов в связи с получением а1штоксинных npeaa r ратов..5

До настоящего времени при изучении ., токсичности культуральной жидкости CS. perfHncfens и C.dipbitieHae как в условиях производства, так и в научных ио-.. следованиях определяют DCm/мл в опытах на лабораторных животных.

Этот способ заключается в следующем.

Различные разведения дифтерийного токсина вводят внутрикожно (после выощ-, пывания шерсти на боках) морской свинке одновременно со стандартным токсином для реакции Шика. Определяют дозу исшл- туемого токсина, которая обусловливает ту же реакцию, что и стандартный токсин.2о Пзгтем пересчета устанавливают величину ПВт/мл. Биологическую активность гвнгренозного, токсина определяют на белых мышах.

Каждое разведение токсина в физиологическом растворе в объеме О,5 мл (вводят двум белым ъеьапам внутривенно (в хвост). Отмечают наибольшее разведение токсина, которое вызывает половины взятых в опыт мышей в течеиие 2-х суток. Ток СИЧНОСТ1, выражают в Т)6т /мл.

Однако лабораторные животные цорого стоят (1 белая мышь - 4О коп., 1 морокая свинка - 7 руб. 96 коп); для содер жания животных необходимо специальное помещение - виварий; способ сложен в технике выполиения (внутривенное Введение белым мышам - в хвост, внутрикожное введение морским свинку).

Наиболее близкш { к изобретению является метод серийных или последовательных разведений, сущность которого заклк чается в том,что из испытуемого вещеотва делается серия /последовательных разведений, так, чтобы каждое последующее разведение было в ;2 или 3 раза боль ше предыдущего tl. Для этого разливают питательную среду в пробирки в равных объемах ВНОСЯТ в первую пробирку ра&вый объем испытуемой жвдкостп и тщательно перемешивают. Перепиваю|; to первой про бщжи во втЬрую половиву содервквмого, перемешивают, из второй - в третью в т.д. Засевают пробирки одинаковой дозойтест-микроба. Через 18-2О роста в термостате отмечают при каком максимальном разведении отсутствует рост тес - дикроба. Это разведение принимают за титр или активность испыту лой жидкости. Однако известный способ не позволяет определить слабо выраисенвую токсичность т.е. обладает невысокой чувствительностью. Нестандартность питательных сред оказывает значительное влияние на рост микроба и, следовательно, искажает результаты определения биологической активности на основе роста мнкроорганвз мов. Способ не -позволяет получить Biooпровзводимые результаты. Кроме того, на его осуществление затрачивается мно го времени. Поэтому известный метод нельзя использовать для определентш токсичности культуральной жидкости на начальных этапах выращивания микроорганюмов, © также при изучении ела-) бык ТОКСИНОВ Цель изобретения - определение активности экзотоксинов микроорганизмов рода клостридиум и рода коринебактериум Для достижения цели в способе ощэеделения активности продуктов метаболиэ ма микроорганизмов, включающем посев тест-микроба в определенных дозах в серию пробирок с различными соотношениями смеси продуктов метаболизма и бульона, экспозицию с последующей onea кой их активности продукты метаболизжа экзотоксины смешивают с бульоном в со отношениях: 4,5 - 0,5 : 0,5 - 4,5, в качестве тест-микроба используют штамм E.ooEi К - 12; 200 PS , экспозицию проводят в течение 6-8 ч, а активность оценивают в относительных единицах и гибирования роста тест-микроба. П р и м е р. В ряд пробирок разлива ют питательную среду (бульон) в возрастающих объемах. В каждую пробирку вносят культуральную жидкость (экзоток син) в убывающих объемах. Содержимое каждой пробирки тщательно перемеш вают. Получают следующие соотношения экзотоксина и бульона: в пробирке №1 - 5,0 мл экзотоксина №2 - 4,5 мл экзотоксина и 0,5 мл бульона, №3-4,0 мл токсина и 1,О м бульона, №4 - 3,5 мл токсина и 1,5 м бульона и т.д. до одиннадцатой пробирки, в которой 5,О мл бульона. Все пробирки засевают одинаковой дозой тест-микроба и в термостат при . Через 6-S. ч роста О1ьределяют визуально с помощыо стандарта мутности шга фоТоэлектроколориметрся -нвфел(эметром оптическую йдотность суспензии в каждой пробирке. Строят график зависимости оптической плотности суспензш (ось ординат) т конд| нтрации экзотокси1аа (ось абсцисс), определяемой по соотношению: экзотоксин - бульон в % экзотоксина. На реи ординат отмечают точку, соответствующую 5()% от максимального значения оптической плотности. Через найденную точку проводят прямую, параллельную оси абсцисс до пересечения с крквой. Через точку пересечения с кривой опускают перпендикуляр на ось абсцисс. Точка пересечения с осью абсцисс дает процентное содержание экзотоксина в оне, соответствующее 5О%-ному ингибированию роста. Делят 100% (цельная кутштуральная жидкость - экзотоксин) на подученное процентное содержание соответствующее 5О% ингибированию, и з:начение токсичности, выраженное количеством единип ишгибирования. За единицу иигибирования Ujo принимак1Т активность тако1Ч, токсина, который в неразведенном состоянии подавляет на 50% рост 7-ми часовой культуры ЕамеНс 1с Cogi К-12 2ОО PS , Теоретической основой предлагаемого способа является нспользоззание принципа ингибирования (подавления) роста культуры гетероло1 чного микроорганизма для введения ношлх единиц взм;ерения биологической активности тсжсинов - единиц вигибировануш. Способ апробирован в Л1аборатории моделирования процессов кулззтивирования микроорганизмов и в цехе вакцин и анатоксинов предприятия по п роизводству бактерийных препаратов МШИВ С им. И. И. Мечникова. С этой целью использованы различные экзотоксины., Тес-г-штамм EsclieHcWa CoBi К-12; 2ОО PS сохраняют в высушенном состояг НИИ в ампуле или в полужидком в пробирке. С полужидкого агара делают пересев петлей в пробирку с бульоном . Хоттингера на 18 ч. После этого делают еще один пересев в бульон на 3 ч. Эту культуру рассевают петлей в пробирки с различными разведениями аспытуемой культуральной жидкости (токсина) в питательной среде (бульоне). При этом пер вая пробирка содержит 5,0 мп токсина, вторая - 4,5 МП токсива и 0,5 мп бупьона, третья - 4,0 мп токсина и 1,0 мл бупьова и т.д. до одиннадцатой пробирки, содержащей 5,0 мп бульода. Культуры и пробирках кыращивают р термостате при 37°С в течение 6-8 ч. Затем определяют мутность выросших культур визуально с помощью стандарта мутнос-iB или оптическую плотность с помощью ФЭК-Н. Строят график зависимостей мутности или оптической плотности ку71ьтуры (оси ораиват) от концентрации экзотокситш в бульоне (ось абсцисс) (фиг. 1,2,3,4,5) Нафиг.1 дано две зависимости, одна и . вз которых построена на основе данных стандарта мутности другая - по показаив ям ФЖ-Н. На оси ординат отмечают точку, соот- ветствующую середине расстояния между началом координат и максимальным значением оптической плотности или мутноо ти. Через найденную точку проводят прямую, параллельную оси абсцисс до пересе чения с кривой. Из точки пе1)есечения опускают перпендикуляр на ось абсцисс. Получают точку, соответствующую процентнетлу содержанию экзотоксина в буль оне при ингибировании роста на 50%. Делят 100% на полученную величину и определяют количество единиц ангибирова ния.. В примере на фиг. 1 в случае использовашш оптической плотности, определенно ной ш ФЖ-Н, количество единиц ингибирования равно 2,33, а при использовании стандарта мутности оно составляет 2,17. Оба метода дают близкие значешт единиц ингибирования. Визуальный метод. снованный на измерении стандарта, мутостн, не уступает методу определения, с омощью прибора. В примерах на 4«r. 2,3,4,5 ледующие величины: на фиг. 2 - 37%, Йг- 2,7ОЭи50/мл; 1 ПП на фиг. 3 - 79%, jy 1,26Эи 50/мл} на фиг.4 - 73%, i,37JU50/мл; а фиг. 5 - 11%, .122- 9,O9:)U 50/мл. Эти значения хороша коррелируют с еличинами D2m/мл, определенными в тех е пробах опытами на животных: 50ОСРт/мл соответствует 1,263и5О/мл или 1,37ЗУ 50/мл; ЮООВЙЯ/мл соотетствует 2,707i/ 5О/мл; 10ОООО соответствует 9,09 С/Х-бО/мл. Табл. 1 иллюстрирует разницу чу&- ствительности известного и предлагаемого способов на примере токсина Сб. perfrincj-ens типа Д. Иа табл. 1 видно, что, ориентируясь только ва известный метод, можно было бы заключить, что испытуемое вещество не обладает токсичностью, т.е. токсичность его равна нулю, поскольку во всех пробирках обнаруживался рост тест-микроба, обозначаемый знаком +. Од1шко в опытах на белых мышах установлено, что данный экзотоксин обладает токсичностью, измеряемой 80ОВОт/мл. Предлагаемый способ позволил определить, что испытуемое вещество токсично, поскольку в пробирках, содержащих от 1ОО до 7О% испытуалогО вещества, роста тест-микроба не было, что обозначается знаком -. В пробирках с опношением экзотоксина к бульону, равным 3/2, т.е. 6О%, был слабый рост ±, что соответствует 1ОО/7О 1,4 единицам ингибирования.

см 4м И

ю

ю to

t. +

со ю

см

01

t см

со (О +

со см и н

и

о

со со

со о

§

и

см

-1 +

со

СО

Ю ю

S и см.

со

гЧ (О

m

ю

с:

см

8

00

и н

со и

ю .

см

см

:i

о + ; о I юю и

и

ае

Що

ю о

о +

8

со ю н

8

.«б .g

§

I I . I

+ I -И

g

о 4J

CD

R «

со rt

S «

8 «

sl«

о о

к

ta ш ф

В

« ш о о ю

о Таким образп«4, даже если использовать визуальный учет результатов, что было оделаво для достоверности сопоо тавяешая способов, предлагаемый способ позволяет охфеделить биологическую ак твввость тсжсвиов, веопределяемую кэвестшдм способом :за счет расширвния дт1шзоиа используемых ковшвнтрапвй экзотоксина. Предлаг 1емый метод исключает невоощ о|оводимость результатов, обусловлен иую влиянием иестаздартиоств питательных сред нз щжродвого сырьа на результаты определе|шя, поскольку на каждой среде за основу расчета степени ивгнбвЭковомическибиологической актв известным методо рованяя принимают модель 50% шпщбирования роста микроба в даииых условяйх. Эту модель получают путал дёпен1ш:ва 2 з.вачеиия оптичшжой imoTBOcni cgrcnet зии, выросшей в пробярге е буюлтмц ве содержащей экзотоксина. - ,--..-.: Экоисмичеюкий расчет, прёоввяеввый в табл. 2 и табл. 3, свядетвльстц т о высокой «кономичвоста iqpeaiiaiiaeMori). способа, поскольку ои поэвояает сократить расходы ва onpef neBee биологической активности токсива в услсвввк 11ро1С1в6дь. ; ства дифтерийвого и гавгренозвого aeai оксина. Т а б лиц а асчет определевия ти одной пробы токовиа лабораторных животных

Гангренозный 12 белых 4 руб. S7 коп. токсинмышей

Экономический расчет определения бийлогтеской активности одной пробы токсина предлага и(ым методом Гангренозный. токсин25мл 2 коп.19 коп. Дифтерийный токсин25 мл 2 коп.19 коп. . Формула изобретения Способ определения активности продуктов метаболизма микроорганизмов, вюпочающий посев тест-микроба в одинаковых дозах в серию пробирок с различиыми соотношениями смеси продуктов метаболизма и бульона, экспсхэиаию с последующей оценкой их активности, отличаю.48 час. 4руб. 87коп.

Таблица с 40 час. 21 коп. 4О час. 21 коп. щ В И С Я г&л, что, с оельЬ определения активности экзотоксинов микрооргаBB3MI рода клостридиум и рода корнве бактериум, продукты метаболизма - экзо токсивы смешивают с бульоном в соотвшаеепи4,,5:0,5-4,5, в качестве тест мвкроба используют штамм Е .CoCt 2ОО PS , экспозицию проводят &-8 ч, а активность оценивают в относи1199394712

тельных едвнвиах ннгабврованвя роста1. Красилышков Н.А. Методы язучетест-члекроба.ния почвенных микрооргани: мов и их меИсточннкн ннформашга,таболитов. М., МГУ, 1966,, с. 152, 170

принятые-во внвманне при экспертизе(прототип).

Х.

9,зкет

2,3V50/Mfr

fff.Mym. IS. О

W.0

5,0

% Конц. токсина,

100

2,7 3U50IH/I

НИИ |М

ifS

О

n#r,

20

Фиг. /

90100 /о

Aff/f ц. токсина

ол

fd. зкст 20 0ffO ОЛ E9.9ICC т 60 Фиг 4 - 1,27JUyO/Mff 80WO / 79/ff(oHf,ifj0,fcutta, % .37Jl ffO/H/f % 73 /o Кенц, moffcttfta, f$,3Kcm.

11%

Wffffffff fffff

Фиг 5 омц. /noircti a, % 9.в9У0501мя