Штамм еSснеRIснIа coLI р-69-тест-культура для количественного определения @ -пролина в биоорганических смесях Советский патент 1983 года по МПК C12N15/00 C12P13/24 

(54) ШТАЛ-Ш I ESCHERICHIA COLI ,9-ТЕСТКУЛЬТУРА ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ L. -ПРОЛИНА В БИООРГАНИЧЕСКИХ СМЕСЯХ

1

Изобрегение относигея к микробиологической промышленности и касается нового штамма бактерий - тест-культуры для количественного определения L, -про- лина в различных питательных средах, культуральных жидкостях и различных органических смесях.

К штаммам тест-культурам для качественного и количественного определения аминокислот микробиологическим методом предъявляются следующие требования:

Штамм должен обладать высокой скоростью роста для обеспечения быстроты (непродолжительности) процесса определения количества данной аминокислоты;

штамм должен быть высокочувствителен к изменениям концентрации определяемой аминокислоты для обеспечения высокой точности процесса определения количества данной аминокислоты;

штамм не должен быть чувствителен к другим веществам, содержащимся в испытуй ой пробе, для обеспечения точности количественного определения данной аминокислоты независимо от присутствия в образце посторонних примесей. Этим определяется широта областей применения штамма J

штамм не должен быть патогенным для человека и не должен вызывать кожные и аллергические реакции у персоналаштамм не должен быть спорообразуюfQ -щим, чтобы не разгрязнить лабораторные и производственные помещения посторонней для данного производства микро- флорой.

Известен штамм Neurosporq fcroissct J5 используемый для микробиологического количественного определения Ц -пролина .

Однако этот штамм не отвечает современным требованиям, предъявляемым к тест-культурам, а именно

скорость роста штамма Neurospora CrqsSci очень низка, в результате чего продолжительность анализов досгт аег 2ОО ч. Культура Neurospora crossa 39 обладает высокими протеолитическими свойствами, что делает его непригодным для анализа биоорганических см&сей, имеющих в своем составе наряду со свободными аминокислотами белки, пептиды и т. п. Меигозрога crasso относится к спорообразующнм микроорганиз мам. Из-за своих малых размеров споры легко попадают в воздушную среду, вслед ствие чего они являются источником загрязнения и нестерильносги лабораторных и производственных помещений. Споровая культура может являться также фактором вызывающим аллергическую реакцию у лаборатррного и производственного персонала. Целью изобретения является штамм бактерий, обладающий большей скоростью роста (I 8-20 ч) и чувствительностью к содержанию L, -пролина в среде и создающий возможность определения Ь -пролина в биоорганических смесях, а также более безвредного для персонала, вследствие необразования спор. Полученный штамм Neurosporoi trassa Р-69, ауксотрофный по пролину, характеризуегся следующими свойствами. Морфологические признаки. Подвижная, грамотрицательная палочка, спор не образует. Размеры суточной культуры в мясном бульоне (1,2-1,6) мк (0,6-0,8) мк. В условиях фазового контраста цитоплазма выглядит гомогенной с небольшими уплотнениями на концах клетки. Культуральные признаки Хорошо растет на всех питательных средах (мясо-пептонный агар, агар на гидролизате рыбной пасты, среда Эндо), при инкубации на агаровых средах через 1 сут образует круглые, гладкие, бесцвет ные, плоские колонии с ровньтми краями. Диаметр колоний - 1-суточной культуры 2-3 мм. Имеют мягкую консистенцию, обрайувт гомогенную суспензию. На среде Эндо колонии окрашенБ в цвет фуксина, с металлическим блеском. На мясопептонном бульоне и других питатель ных жидких средах образует равномерную муть и небольшой осадок. . Растет на синтетической среде М9 с добавкой 1О-2О мкг/мл Ц -пролина. Физиологические признаки. Оптимальная температура для роста . 37° С, Оптимальная рН среды 7,О-7,4 Расщепляет лактозу, глюкозу, мальтозу,55 арабинозу, ксилозу, маннит с образованием кислоты и газа, продуцирует индол и сероводород. Разжижения желатины не 364 насгупаег, по укопу получают сероватобелый рост. Мопоко свертывается, лакмусовое молоко розовеет и коогулируегся. Непатогецен для человека и животШтамм получат следующим образом. Для получения ауксотрофного по пролину,мутанта Е. coKi в качестве мутагенного фактора используют 1-метил 3-нитро-1-нитрозогуанидин, 5 мл культуры в логарифмической фазе роста дважды центрифугируют, ресуспендируют в 5 мл ацетатного буфера (рН-5,6), содержащего 6О мкг/мл нитрозогуанидина, и перенося в водяную баню при 37 С на , Обработанную суспензию отмывают от мутагена авукратным центрифугированием (4ОООО об/мин, 20 мин) и промыванием f буфере, после чего бактерии ресуспендируют в свежем мясо-пептонном бульоне и подращивают в течение 3-х ч при постоянном перемешивании для избавления от мутационных гетерозигот, высевают на мясо-пептонный агар из расчета около ЮО клеток на каждую чашку Петри и инкубируют в термостате при 37° С в течение 1 сут. Выросшие колонии пересевают на параллельные чашки с мясо-пептонным агаром и синтетической средой М9 следующего состава, г: 1,0; Nc(,2HP04 . 6,0; 3,0; На се 0,5; агар 11,0, вода 100О мл. Колонии, выросшие на мясо-пептонном агаре, но не выросшие на среде М9, пя1Ъ раз пересевают на чашки с мясо-пептонным агаром.- Выделенные таким образом и очищенные пятикратным пересевом культуры проверяют для установления потребности в факторах роста высева на чашки со средой М9 с добавлением аминокислот, витаминов и азотных оснований. Из общей массы полученных ауксотрофных мутантов выделяли те, которые для своего роста нуждаются в добавлении в среду L, -пролина. В результате многократных проверок установлено, что полученный щтамм Е. coCi Р-69 строго специфичен и высоко чувствителен к L, -пролину и не реагирует на присутствие в среде других аминокислот. Пример. (Определение содержания L, -пролина в синтетической среде М9 с помощью штамма Р-69), Проводят испытание штамма Р-69 для определения L,-пролина. Для этого проверяют количество L, -пролина, в синтетической среде М9, содержащей различныв копичесгва L,-пропина. По реаупъгагам таких опрепелёнйй сгроигся кривая зависимости опгической плогносги расгушего шгамма ог содержания пропина в образце. Кривая сгроигся пугем внесения определенного копичесгва к легок шгамма в качесгве гесг-купьгуры в пробирки, содержащие L, -прояин различной кошхенг рашш (ОД; 5; Ю; 20; ЗО; 40; 50; ЮО; 2ОО; 5ОО; мкг/мп). Пробы инкубируюг в гечение 18-2 О ч при 37 ° С после чего нефеломегрически определяют характер зависимосИ опгической шютаос ги (мутности суспензии вьфосшей гесгкульгуры) ог количесгва U -пролина в расгворе. На чертеже предегавлено гра- . фическое изображение зависимости опгической плогносги расгущей E.coPi Р-69 ог концентрации ( -пролина. Наибольшая чувсгвительносгь культуры к L, -пролину наблюдается в пределах I 0,2-8 мкг/мл аминокислоты в среде. I П р и м е р 2. Определение U-пролина в ферментационных средах и культу ральных жидкостях., Подготовка аи изируемых образцов. Пробы культуральных жидкостей, а также ферментационную среду стерелизуют в автоклаве в. течение ЗО мин под давлением I атм, отделяют ценгрифугированием от взвешенных частиц и микроорганиз мов (40ОО об/мин, 20 мин). С целью окончательной очистки проб надосадок разводят .в минимальной среде М9 и инкубируют в кипящей:.водяной- бане. Появив шуюся после обработки муть осаждают повторным центрифугированием. Полученный таким образом недостаток в зависимости ог ожидаемой концентрации Ь пролина разводят в соответствующее число раз в минимальнойсреде М9, слецующего состава, г: I; МалНРОА1б; КН2Р04 . 3; NcjCe 5; вода - 1л. Разведения подбираются гак, чтобы содер жание аминокислоты укладывалось в стан даргную кривую. Определение ведут в стандартных пробирках, в которые разливаюг по 4 мл ми нимальной среды.. В первую пробирку вн сят 1 мл испытуемой пробы и пс(сле тщательного перемешивания 1 мл переносят во вГОруЮ пробирку и г. д. Из ПОС-. ледней пробирки t мл жидкоеги огбрасывают. Каждое разведение берут в грех повторноетях. Подготовка индикаторной культуры. Ауксотрофную по пролину культуру E.COCi Р-69, выращенную в 2 мл питательного бульона, перейосяг в минимальную среду М9, содержащую Ю мкг/мл t. -лролина и инкубируюг сгационарно в течение ,16 ч при 37 С. Тигр культуры должен достигнуть 1,О-5,О-1О.. До начала . определения культуру ценгрифугнруюг и ресуспендируюг в стерильной минималь ной среде.; Опытные пробирки с разведениями иследуемых образцов инокупируюг опреде,1енным количеством суспензии индикагорного штамма из расчета, чтобы конечный тигр кульгуры получался около 0,5 IО . Инкубируюг в гечение 2022 ч при 37° С. Учет щгенсйвности росга Е. проводяг фотометрированиетл. Последующее определение содержащга /U.- пролина проводят по стандартной Кривой. Построение стандартной кривой. Для построения стандартной кривой в ряд пробирок с растворами различных конценграций чистого Ц -пролина (ЮО, 50, 20, Ю, 5, 2, I, О,5, ОД мкг/мл) параллельно с опытными гфобирками доббшляют определенное количество суспеиии индикаторного шгамма. Инкубируюг в гечение 2О-22 ч при . Определение мугности проводят фотометрированием. Растворы I, -пролина гоговяг в ivhoiKManb ной среде М9. Объем расгвора в пробирке 4 мл. Опыт ставят в трех повторностях. По средним значениям мутности строят стандартную кривую зависимости оптической плотности от концентрации L, -пролина в среде (чертеж). На чертеже изображена кривая для определения количества L, -пролина с помощью тест-культуры t.соEi Р-69, где на оси абсцисс отражена описческая плотность, а на оси ординат - концентра- ция I, -пролина в мг/мл. П р и м е р 3. Использованиештам ма .СОЙ1 Р-69 для определения концентрации U -пролина в компонентах ферментационных -сред: гидролизаге БВК (белково-вигаминный концентра г) и мелассе. Различные партии БВК и Мелассы отличаются содержаниетл аминокислот, в том числе к. пролина. Для стабилизации состава ферментационных сред необходимо знать точное количесгво аминокислот, гак как в некогорох случаях их недостаточное количесгво или излишек влияет на выход конечного продукта ферментации. Для определения количесгва пролина гидролизат БВК сгерилизуют в авгоклаве (I атм, ЗО мин), разводят в мини- мальной среде М9 в определенное коли79964чесгво раз (5, Ю, 2О раз и г, д.) и инокупируюг пред вари гельно шадготовлеи. Ной культурой. Пробирки инкубируют стационарно в термостате при 37 С в течение 18-2U 4.5 Вепичины оптических плотностей после фотометрирования откладывают на стан дартной кривой н определяют количество пролина в пробах. При определении- содержания пролина в мелассе навеску мелассы предварительно разводят в минимальной среде (25 раз), стерилизуют, центрифугируют и далее разводят (в 5О, 1ОО, 125 и более раз) в зависимости от ожидаемой концентрации пролина. П р и м е р 4. Определение содержания пролина в моче. При определении содержания пролина ъАоче,, последнюю инкубируют в кипящей водяной бане в течение 4О мин для осаж дения взвешенных частиц и заражают индикаторной культурой р, CoEi Р-в9. Ответную реакцию тест-культуры на наличие в пробах пролина определяют фотометрированием после 18-2О ч роста. Количество аминокислоты определяют по стандартной кривой. О 68 Минимальная доза пролина, при которой наблюдается рост индикаторной культуры E.coCi Р-69 - 0,2 мкг/мл. В диапазоне концентраций пропина О,28,0 мкг/мл интенсивность роста культуры пропорциональна количеству г«)го вещества в среде. Предложенный штамм Esctiertcflid Р-69, ауксотрофный по пролину, обладает большой скоростью роста и чувствительностью к содержанто L, -пролина в пробе и создает возможность определения L -пролина в различных биоорганических смесях. Формула изобретения Шгамм EscfieriCti-id Р-69 (коллекция Музея культуры промышленных микроорганизмов филиала института ВНИИгенетика, коллекционный номер ТК-691) - тест-культура для количественного определения L, -пролина в биоорганических смесях. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. Brand etal, , J. Amer.chem. Soc., 67, .