Штамм бактерий YeRSINIa реSтIS, предназначенный для проведения генетических и микробиологических исследований Советский патент 1992 года по МПК C12N1/21 C12N15/01 

Изобретение относится к микробиологии и генетике.

Известны мутанты чумного микроба, зависимые от азотистых оснований. Как правило эти мутанты получены под действием различных физических факторов в химических агентов и используются для проведения различных микробиологических, и генетических экспериментов 1.2,3.

Для изучения генетики возбудителя чумы необходимо создание доступной для специалистов коллекции с максимально возможным набором маркированных штаммов. До настоящего времени не получены цитидинзависимые штаммы чумного микроба.

Целью изобретения является получение штамма для проведения генетических и микробиологических исследований.

Полученный цитидинзависимый штамм чумного микроба Y.pestls C-3332cyd- хранится в коллекции Всесоюзного музея живых культур Всесоюзного научно-исследовательского противочумного института Микроб под номером КМ-250. Штамм имеет следующие морфологические и физиологические характеристики.

Величина клеток двухсуточной бульонной культуры составляет 1-2 мк, грамотри- цательные, овоидной формы, биполярно окрашенные.

Дает агглютинативный рост в прозрачном бульоне с мелкохлопчатым осадком на дне пробирки. На агаре Хоттингера формирует пигментированные колонии с зернистым центром и периферической зоной диаметром 2-2,5 мм. Температура оптимума роста 28°С.

Ферментирует глюкозу, маннит, араби- нозу, дульцит, рамнозу. Не разлагает: лактозу, сахарозу, дульцит, раффинозу, отрицательная урезаная активность, не дает реакцию нитрификации. Отсутствует фибринолитическэя и коагулаэная активность, не пестициногенен и чувствителен к пестицину.

На среде Джексона-Берроуза формирует пигментированные колонии, на магние- во-оксалатной среде Хигучи-Смита вырастают кальцийзависимые клетки. Цити- динзависимый мутант продуцирует фракцию 1, чувствителен к стрептомицину, тетрациклину, пенициллину.

Проявляет чувствительность к чумному фагу Покровской, фагу Л-413 С и псевдотуберкулезному диагностическому бактериофагу.

Вирулентен для белых мышей и авиру- лентен для морских свинок.

Зависим от пиримидинового нуклеози- да-цитидина.

П р и м е р 1. Способ получения штамма Yerslnla pestls KM-250.

Фагоцитирующие клетки - полиморф- ноядерные лейкоциты (ПМЛ) и макрофаги (МФ) оказывают мутагенное действие на ряд микроорганизмов - E.coll, S.typhlmurium, P.flscherl, что было показано в опытах In vitro. Активным началом ПМЛ и МФ являются дериваты кислорода: супер- оксидный анион (ОН), перекись водорода

(Н202) И ДР,

Мутагенное действие фагоцитов на чумной микроб в опытах In vitro продемонстрировано в работе Атчабарова с соавт 4.

Мутант Y.pestls KM-250, получен из природного штамма. Y.pestls С-3332 In vivo под действием стимулированных и резидентных ПМЛ и МФ в брюшной полости большой песчанки (Rombomls oplmus) - основного носителя чумного микроба в пустынных очагах чумы.

В опытах используют, как и In vitro, предварительную стимуляцию выхода в брюшную полость большой песчанки ПМЛ с последующим введением туда чумного микроба и смывом его после умершвления животного. Оценку результатов взаимодействия фагоцитов и возбудителя чумы проводят после изучения свойств субкультур штамма чумного микроба взятого в опыт.

П р и м е р 2. Использование штамма КМ-250 для изучения метаболизма пирими- диновых оснований. Из суточной агаровой культуры чумного микроба КМ-250 и С-3296 (штамм выделенный в высокогорном Закавказском природном очаге) по стандарту мутности (10 единиц) готовят суспензию в

забуференном физиологическим растворе (рН 7.2) с концентрацией микробных клеток 10 в 1 мл. Пипеткой переносят 0,5 мл испытуемой культуры в пробирки с 4,5 мл физиологического раствора, доводят концентрацию микробных клеток до 108 в 1 мл. Из разведения Y.pestls KM-250 бактериологической петлей (диаметр 2 мм) делают посев двумя штрихами (2,5-3 см) на пластинку минималь0 ного агара следующего состава (Минимальная среда - МС): 1000 мл дистиллированной воды; 15,0 г агар-агара; 30° мл 10% раствора хлористого кальция; 7,0 г двухзамещенного ортофосфата калия; 2,0 г однозамещенного

5 ортофосфата калия; 0,5 г цитрата натрия; 0,1 г сульфата магния: 1,0 г сернокислого аммония; 3,0 г глюкозы; 0,5 г сульфита натрия; цистеин, фенилаланин, метионин,треонин, аргинин, тиамин по 50 мг.

0 Из конечного разведения штамма С- 3296 производят высев двумя штрихами на ту же чашку с МС следующим образом: первый штрих проводят перпендикулярно посеву штамма C-3332 cyd- на расстоянии 3

5 мм от края штриха, второй - параллельно на том же расстоянии. Посевы таким методом делают на 3-4 пластинках минимального агара. Место посева каждого штамма метят. Чашки с посевами инкубируют при 28°С.

0 На 2-3 сутки вырастают все посевы штамма С-3296, а штамма КМ-250 лишь в местах наиболее близких к посевам штамма С-3296.

Полученные данные позволяют сделать

5 вывод о синтрофизмеобеспечении потребности в пиримидиновых основаниях штамма (Y.pestls KM-250) с блоком их биосинтеза, промежуточными продуктами метаболизма штамма Y.pestls С-3296 с ненарушенными

0 путями их биосинтеза.

П р и м е р 3. Использование штамма Y.pestls KM-250 для изучения пиримидинового оперона. Из суточной агаровской культуры чумного микроба штамма Y.pestls

5 КМ-250 и С-3296 по стандарту мутности (10 единиц) готовят суспензии в забуференном физиологическом растворе (рН 7,2) с концентрацией микробных клеток 10 в 1 мл. Пипеткой переносят 0,5 мл суспензии в про0 бирку с 4 мл физиологического раствора, доводят концентрацию до 10 микробных клеток в 1 мл, Из этого разведения микропипеткой переносят 10.0 мкл (10б микробных клеток) на плотные питательные среды (по5 сев бляшкой) следующего состава: минимальная среда (аналогичная МС в примере 1); МС с добавлением цитидиловой кислоты (50 мг на 1 л среды); МС с добавлением уридинэ (50 мг на 1 л среды); МС с добавлением цитидина (50 мг на 1 л среды).

Чашки с посевами инкубируют 2-3 сутПолученные данные позволяют сделать запри 28 С.ключение о месте блока путей синтеза пириШтамм чумного микроба КМ-250 растетмидиновых оснований у испытуемого

лишь на среде № 4 (с добавлением цитиди-штамма.

на). Тогда как штамм С-3296 растет на всех5 Формулаизобретения

указанных средах.Штамм бактерий Yerslnla pestls KM-250.

Цитидиловая кислота, уридин являютсяпредназначенный для проведения генетичепредшественниками биосинтеза цитидина.ских и микробиологических исследований.

Изобретение относится к микробиологии и генетике, в частности для генетических и микробиологических экспериментов в качестве маркированных штаммов. Целью изобретения является получение штамма для проведения генетических и микробиологических исследований при изучении ге- нотипических и фенотипических свойств чумного микроба. Путём мутагенного воздействия фагоцитирующих клеток большой песчанки получен мутант чумного микроба, стабильно сохраняющий зависимость от ци- тидина. Штамм депонирован в коллекции Научно-исследовательского противочумного института Микроб под номером КМ-250. Ё