ТЕСТ-ЗАРАЖАЮЩАЯ КУЛЬТУРА ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ ИММУНОГЕННОСТИ СИБИРЕЯЗВЕННЫХ ВАКЦИН, ЭФФЕКТИВНОСТИ СРЕДСТВ ЭКСТРЕННОЙ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ Российский патент 1999 года по МПК C12N1/20 A61K39/07 

Изобретение относится к иммунологии и микробиологии и может быть использовано при определении иммуногенности сибиреязвенных вакцин, эффективности средств экстренной профилактики и лечения и сравнительном изучении вирулентности различных сибиреязвенных штаммов.

Известен сибиреязвенный штамм 71/12 второй вакцины Л.С. Ценковского, который является вакцинной капсулообразующей культурой. (Основные критерии отбора сибиреязвенных вакцинных штаммов, предназначенных для изготовления живых сибиреязвенных вакцин для иммунизации людей. - Методические указания. -Москва. 1982.-21 с. -Составители: Салтыков Р.А., Чалисов И.А., Уланова А.А. -Государственный научно-исследовательский институт стандартизации и контроля биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича).

Однако этот штамм не может быть использован в качестве тест-заражающей культуры в силу того, что он является вакцинным штаммом и обладает вирулентными свойствами только для белых мышей и морских свинок, для кроликов и овец - не вирулентен. Данный штамм был получен в результате аттенуации вирулентного родительского штамма в условиях повышенной температуры: 42,5 - 43^oC. Под действием повышенной температуры у него произошла частичная элиминация внехромосомной термочувствительной плазмиды p X01, ответственной за биосинтез токсина, вторая внехромосомная плазмида p X02, ответственная за капсулообразование, сохранилась. Поэтому токсин продуцирует лишь незначительная часть популяции штамма 71/12, так как ее большая часть не имеет плазмиды p X01.

Целью изобретения является использование штамма 81/1 возбудителя сибирской язвы, как тест-штамма, обладающего универсальными свойствами и обеспечивающего возможность его применения не только в качестве типичного штамма при внутривидовой дифференциации различных штаммов, но и при определении иммуногенности различных видов и серий сибиреязвенных вакцин, оценке эффективности средств экстренной профилактики и лечения сибирской язвы.

Преимущества заявленного штамма перед известным, обеспечивающие решение поставленной задачи, заключаются в том, что он является высоковирулентным к живым организмам, имеет 97,3 ± 2,7% колониеобразующих единиц, которые синтезируют капсулу и продуцируют токсин, а также стабильно сохраняет свои культурально-морфологические и биохимические свойства, типичные для сибиреязвенного микроба (срок наблюдения 25 лет).

Штамм Bacillus anthracis 81/1 имеет следующие характеристики:
Культурально-морфологические свойства.

Возбудитель является Грам-положительной палочкой. При окраске генцианвиолетом по Ребигеру клетка окрашивается в синий цвет, капсула - в розовый. В мазках из культуры, выросшей на питательных средах, палочки располагаются в виде длинных цепочек, концы которых в местах их соединения выглядят обрубленными, напоминают бамбуковую трость с коленчатыми сочленениями. В мазках из органов и крови бациллы располагаются преимущественно одиночно или попарно, окружены капсулой.

Штамм неподвижен.

При культивировании на 1%-ном бикарбонатном агаре Хоттингера с добавлением 10% инактивированной лошадиной сыворотки в атмосфере 50% СО₂ вырастает капсульная форма микроба, которая формирует S-форму колоний. Это крупные, блестящие, слизистые колонии с неровными краями.

Является спорообразующим микроорганизмом. В ходе спорообразования споры в спорангии располагаются центрально, имеют овальную форму, не превышают диаметр тела микроба и не деформируют его.

Устойчивость штамма 81/1 к физико-химическим воздействиям типичная для сибиреязвенного микроба.

На твердых питательных средах регистрируется типичный рост в R-форме: колонии крупные, плоские, шероховатые, матово-серые, периферия их бахромчатая с локонообразными отростками нитей сибиреязвенных бацилл, отходящих от центральной части колонии. При просмотре под малым увеличением микроскопа колонии имеют вид локонов, похожих на львиную гриву.

На жидких питательных средах наблюдается типичный рост в R-форме: бульон прозрачный, при встряхивании пробирки не мутнеет, на дне пробирки - рост в виде комочка ваты, с трудом разбивающегося при встряхивании.

Вирулентность. Штамм является вирулентным. В организме экспериментальных животных образует капсулу. Вызывает гибель нелинейных белых мышей, морских свинок, кроликов и овец на 2-5 сутки после их подкожного заражения, а также типичные для сибиреязвенной инфекции патологоанатомические изменения: в месте введения культуры имеется студенистый отек подкожной клетчатки, инъекция подкожных сосудов. Регистрируются увеличенные лимфатические узлы, печень, селезенка, гиперемия внутренних органов, несвернувшаяся кровь. Для нелинейных белых мышей LD₅₀ составляет 10(6-14) спор, для морских свинок LD₅₀=76 (32-182) спор DCL для овец равняется 1000 спор, для кроликов DCL = 10000 спор.

Биохимическая активность штамма. Протеолитически активен, гидролизует казеин, желатин, альбумин, гемоглобин, фибриноген. Не продуцирует пенициллиназу, тест "жемчужного ожерелья" отрицательный. Фосфатаза отсутствует - тест на фосфатазу на селективной среде с добавлением 0,001% фенолфталеинфосфата натрия отрицательный. Проба на гемолиз на кровяном arape с добавлением 5- 10% дефибринированной крови барана отрицательная. Тест на лецитиназу на агаре с яичным желтком отрицательный.

Отношение к специфическим бактериофагам. Лизируется сибиреязвенными бактериофагами К и Гамма.

Отношение штамма к видовым диагностическим сывороткам. При окраске споровых, капсульных и вегетативных форм соответствующими антиспоровой и капсульно-соматической сыворотками регистрируется специфическое свечение.

Антигенные свойства штамма. Содержит соматический, капсульный и споровый антигены, продуцирует экзотоксин.

Питательные потребности штамма. Является факультативным анаэробом. Хорошо растет на обычных питательных средах: мясо-пептонном агаре, бульоне, arape и бульоне Мартена, Хоттингера. Температурный оптимум роста 35±2^oC, оптимум pH среды 7,0 - 7,8 ед.

Споры формируются на среде Гладстона-Филдса на 3-7 сутки выращивания при 35^oC.

Генетические особенности штамма. Устойчив к полимиксину, чувствителен к бензилпенициллину, стрептомицину, тетрациклину, ампициллину, рифампицину, доксициклину.

Условия для хранения штамма. В спорах, в стеклянных запаянных ампулах, в 30%-ном растворе глицерина, при +4^oC.

Способ получения штамма. Выделен в естественных условиях, в лаборатории сибирской язвы Ставропольского научно-исследовательского противочумного института Н. П.Буравцевой 22 августа 1972 г. из карбункула больного сибирской язвой, проживавшего в ст. Расшеватка Ставропольского края.

Штамм стабильно сохраняет свои культурально-морфологические, антигенные, биохимические и вирулентные свойства, типичные для возбудителя сибирской язвы, а также однородность популяции, в том числе по основным факторам вирулентности: капсуло- и токсинообразованию, с момента выделения (1972 г.) и по настоящее время.

Наиболее достоверным методом оценки напряженности противосибиреязвенного иммунитета как поствакцинального, так и постинфекционного, является метод прямого заражения лабораторных животных (Абалакин В.А. с соавт. Оценка антитоксического противосибиреязвенного иммунитета //ЖМЭИ. -1990.-N 12.-с.78-82; Буравцева Н.П. Специфическая и экстренная профилактика сибирской язвы//Дисс. д-ра. мед.наук.-Саратов.-1991. 389 с.). Напряженность поствакцинального иммунитета при сибирской язве определяется по индексу иммунитета. Предварительная оценка иммуногенности вакцинных штаммов проводится на морских свинках с использованием тест-заражающей культуры 2-й вакцины Ценковского, штамм 71/12, после чего необходима проверка с использованием высоковирулентного штамма сибиреязвенного микроба. В опытах на кроликах и овцах иммуногенность вакцинных штаммов оценивают путем заражения вакцинированных животных только высоковирулентным штаммом возбудителя (Основные критерии отбора сибиреязвенных вакцинных штаммов, предназначенных для изготовления живых сибиреязвенных вакцин для иммунизации людей. -Методические указания. -Москва.- 1982. -21 с. ). Однако до настоящего времени отсутствует общепринятый высоковирулентный тест-штамм заражающей культуры при определении иммуногенности сибиреязвенных вакцин. Кроме того, отсутствует и общепринятый тест-заражающий штамм для оценки эффективности действия средств экстренной профилактики и лечения сибирской язвы.

Пример 1. Получение штамма 81/1 (споровой культуры)
Исходную (маточную) культуру штамма в споровой форме в объеме 0,1 мл засевают в 5 мл бульона Хоттингера. Инкубируют при 37^oC в течение 18-20 часов. Полученную бульонную культуру засевают на среду Гладстона-Филдса (300 мл). Дают культуре впитаться и ставят в термостат при 35^oC на 10 суток. Спорообразование контролируют на 3,5,7,9 сутки с помощью мазков, которые окрашивают по Ребигеру. После образования спор у 90-100% микробов бактериальную массу смывают дистиллированной водой и отстаивают в течение 2-3 суток для лизиса оставшихся вегетативных клеток. Затем надосадочную жидкость сливают пипеткой, а споры заключают в 30% раствор глицерина.

Концентрацию жизнеспособных спор определяют методом посева серийных разведений на агар Хоттингера. Для этого делают ряд последовательных десятикратных разведений исходной споровой взвеси с использованием 0,1-0,05% раствора Твина-80 на дистиллированной воде в качестве разводящей жидкости. Взвесь высевают в разведениях 10^-6и 10^-7 на чашки с агаром Хоттингера, в объеме по 0,1 мл. На каждое разведение берут по три чашки. Посевы инкубируют при 37^oC в течение 18-20 часов. Подсчитывают среднее количество выросших колоний из каждого разведения. Среднее значение количества выросших колоний, умноженное на 10 и на кратность разведения, составляет значение концентрации живых спор в выращенной взвеси. Полученную взвесь разливают и запаивают в стеклянные ампулы.

Пример 2. Использование заявленного штамма при определении иммуногенности вакцины СТИ
Опыт включает четыре группы морских свинок (по 30 в каждой) массой 350-400 г. Первую группу животных иммунизируют вакциной СТИ в дозе 1 млн спор, однократно подкожно, в объеме 1 мл. Через 21 день вакцинированных животных заражают подкожно введением тест-заражающей культуры штамма 71/12 2-й вакцины Ценковского в дозах: 100 млн, 10 млн, 1 млн, 100 тыс и 10 тыс спор, по 5 вакцинированных морских свинок на каждую заражающую дозу. Вторая группа животных служит контролем заражения штаммом 71/12 в дозах: 1 млн, 100 тыс, 10 тыс, 1 тыс и 100 спор. Третью группу иммунизируют вакциной СТИ в дозе 1 млн спор. Через 21 день животных данной группы заражают подкожно введением культуры штамма 81/1 сибиреязвенного микроба в дозах: 1 млн, 100 тыс, 10 тыс, 1 тыс, 100 спор. Четвертая группа служит контролем заражения штаммом 81/1, который вводят в дозах: 10 тыс, 1 тыс, 100, 10, 1 спора. Наблюдение за животными ведут 10 дней. Затем определяют величины LD₅₀ заражающих культур штаммов 71/12 и 81/1 для соответствующих групп вакцинированных животных и для контрольных морских свинок. Частное от деления величины LD₅₀ заражающей культуры для вакцинированных животных на величину LD₅₀ такой же культуры для контрольных морских свинок представляет собой "индекс иммунитета", показывающий, во сколько раз вакцинированные животные устойчивее против заражения сибирской язвой по сравнению с невакцинированными животными (таблица 1).

При оценке иммуногенности вакцины СТИ на кроликах иммунизируют 10 кроликов массой 2-2,5 кг подкожно по 250 млн спор в объеме 1 мл. Через 21 сутки заражают вакцинированных кроликов и 3 контрольных кролика в дозах 10 и 50 DCL. За животными наблюдают в течение 10 суток (таблица 2).

Для оценки иммуногенности вакцины СТИ в опытах на овцах берут животных в возрасте 1-1,5 года. 10 овцам вводят под кожу бедра 12 млн спор в объеме 1 мл. Через 21 сутки вакцинированных овец и трех контрольных, непривитых, заражают внутрикожным введением в бедро споровой культуры штамма 81/1 в дозе 10 DCL. Наблюдение за животными ведут в течение 10 суток. Результаты заражения представлены в таблице 3.

Таким образом, из данных примера 2 видно, что заявленный штамм может быть использован в качестве высоковирулентной тест-заражающей культуры.

Пример 3. Использование заявленного штамма при определении эффективности средств экстренной профилактики сибирской язвы
Эффективность средств экстренной профилактики сибирской язвы, в частности антибиотиков, проверяется с использованием высоковирулентных штаммов на белых мышах. Инфицирование проводят подкожно во внутреннюю поверхность бедра. Штамм 81/1 вводят в количестве 100 спор. Через 24 часа после заражения перорально вводят доксициклин, однократно в сутки, на протяжении 3 суток в дозах 0,03; 0,1; 0,3 мг/мышь. Каждая исследуемая группа включает по 10 мышей. Наблюдение за животными ведут в течение 30 суток, на протяжении которых учитывают выживаемость мышей и среднюю продолжительность жизни павших животных (таблица 4).

Таким образом, заявленный штамм Bac. anthracis 81/1 может быть использован при определении иммуногенности сибиреязвенных вакцин и оценке эффективности средств экстренной профилактики и лечения сибирской язвы.

Изобретение относится к иммунологии и может быть использовано при определении иммуногенности сибиреязвенных вакцин, эффективности средств экстренной профилактики и лечения. Применение известного штамма Bacillus anthracis 81/1, используемого ранее для идентификации токсигенных штаммов возбудителей сибирской язвы, в качестве высоковирулентной тест-заражающей культуры при оценке иммуногенности вакцин СТИ у вакцинированных животных по индексу иммунитета показало его пригодность. Процент защиты - разность между процентом выживших вакцинированных животных и контрольных составляет 7,0 ± 5,9 при дозе заражения 10 DCL и 42±9,0 при дозе заражения 50% DCL. 4 табл.

Применение штамма Bacillus anthracis 81/1 в качестве тест-заражающей культуры при определении иммуногенности сибиреязвенных вакцин, эффективности средств экстренной профилактики и лечения сибирской язвы.