СПОСОБ ОТБОРА ЭНДОСПЕРМОВЫХ МУТАНТОВ КУКУРУЗЫ С УЛУЧШЕННЫМ КАЧЕСТВОМ ЗЕРНА Российский патент 1994 года по МПК A01H1/04 

Изобретение относится к биотехнологии и сельскому хозяйству, в частности к генетическим исследованиям злаковых культур, и может быть использовано в селекционной практике для отбора хозяйственно ценных форм кукурузы с улучшенным биохимическим составом зерна.

Применение селекционно-генетических приемов с использованием эндоспермовых мутаций позволяет создавать формы кукурузы с повышенным содержанием лизина и триптофана и сбалансированным по питательной ценности белковым комплексом. При создании перспективных селекционных форм кукурузы возникает необходимость разработки экспрессных способов отбора эндоспермовых мутантов с улучшенным качеством зерна.

Известные способы селекционной диагностики включают экстракцию размолотого зерна водно-спиртовыми растворами с последующим определением содержания спирторастворимого белка (зеина) фотометрическими методами по поглощению окрашенного комплекса в результате обработки полученного экстракта красителем или биуретовым реагентом. Отбор эндоспермовых мутантов проводят по снижению содержания зеина в сравнении с обычными аналогами.

К основным недостаткам указанных способов следует отнести трудоемкость и длительность операций по количественному выделению белка, а также проведение анализа с использованием специфичных реагентов.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту является способ, включающий турбидиметрический тест проламина.

Согласно способа навеску размолотого образца зерна кукурузы высушивают до постоянного веса при 60^о при пониженном давлении и обрабатывают 70% -ным раствором этанола. Образцы гомогенизируют и выдерживают в водяной бане при 60^о в течение 1 ч, затем смесь повторно гомогенизируют и центрифугируют. К аликвоте супернатанта прибавляют 0,2 N раствор хлористого натрия, дважды встряхивают в течение 30 мин инкубации и измеряют оптическую плотность раствора при 590 нм на спектрофотометре.

Отбор селекционных форм кукурузы с улучшенным качеством зерна проводят по абсолютной величине или значению оптической плотности раствора относительно содержания белка.

Основными недостатками способа является необходимость предварительной подготовки образца к анализу путем высушивания до постоянного веса, проведение количественной экстракции проламина с поддержанием установленного температурного режима, необходимость определения содержания белка, что, в конечном счете, ограничивает возможность экспресс-диагностики селекционного материала.

Целью изобретения является упрощение и ускорение способа.

Способ осуществляется следующим образом.

Экстрагируют образцы размолотого зерна стандартной и исследуемой форм кукурузы 40-80% -ным водным изопропиловым спиртом (по объему). Экстракт отделяют фильтрованием и измеряют оптическую плотность при 315 и 260 нм на спектрофотометре и рассчитывают отношение оптических плотностей при указанных длинах волн в качестве сравнительного показателя. Эндоспермовые мутанты кукурузы с улучшенным качеством зерна определяют по возрастанию величины сравнительного показателя в 1,3-1,7 раза по отношению к обычным аналогам. Значения аналитических длин волн (315 и 260) определены экспериментально и соответствуют положению максимума и минимума в спектре поглощения экстракта, поэтому соотношение оптических плотностей обеспечивает максимальную контрастность установленного маркерного признака. В качестве форм кукурузы с улучшенным качеством зерна использованы эндоспермовые мутанты типа о2/o2, o2/o2 su 2/su 2 с установленными биохимическими характеристиками.

Отличительной особенностью способа является определение оптической плотности водно-спиртового экстракта зерна при аналитических значениях длин волн (315 и 260 нм) и проведение отбора по величине отношения оптических плотностей.

По указанным отличительным признакам был проведен патентный поиск. Аналогичных решений не обнаружено, поэтому указанные признаки являются существенными.

П р и м е р 1. Образец размолотого зерна (40 мг) обычной (А 204 +/+) и мутантной по гену опейк-2 кукурузы (А 204 о2/o2) экстрагируют 5 мл водного изопропанола различной концентрации (10-90% про объему) при комнатной температуре в течение 5 мин при постоянном встряхивании. Экстракт отделяют фильтрованием и измеряет оптическую плотность при 315 и 260 нм на спектрофотометре Спекорд М-40 в 1 см кювете. Определяют отношение указанных оптических плотностей (D₃₁₅/D₂₆₀) в качестве сравнительного показателя. Результаты определения сравнительного показателя экстрактов, полученных при различных концентрациях водного изопропанола, приведены в табл. (данные статистически достоверны, ошибка измерения не более 5% ).

Полученные результаты показывают, что при концентрациях водного изопропанола 40-80% установлены наиболее контрастные различия между обычным аналогом и эндоспермовым мутантом (28-43% ), поэтому указанный интервал концентраций растворителя является оптимальным для проведения отбора.

П р и м е р 2. Анализируют аналогично примеру 1 образцы исходой (Wf9 +/+) и мутантной (Wf 9 o2/o2) форм кукурузы с использованием 70% водного изопропанола (табл. 2).

П р и м е р 3. Проводят анализ аналогично примеру 1 образцов исходной (А 619 +/+) и мутантных (А 619 о2/o2, A 619 o2/02 su 2/su 2) форм кукурузы с использованием 70% -ного водного изопропанола (табл. 3).

П р и м е р 4. Аналогично примеру 1 анализируют эндоспермовые мутанты типа o2/o2 su 2/su 2 (линии W 64A, Мк 302, А 293, А 632) с использованием 70% водного изопропанола (табл. 4).

В качестве стандарта используют образцы исходных форм (линии А 204 +/+, Wf 9 +/+, A 619 +/+), значение сравнительного показателя D₃₁₅/D₂₆₀ которых составляет интервал 0,87 - 0,98 при экстракции 70% изопропанолом (примеры 1 - 3). По отношению к указанному интервалу значения сравнительного показателя исследуемых эндоспермовых мутантов (табл. 4) повышены в 1,5-1,7 раза.

Использование предлагаемого способа в сравнении с прототипом позволит упростить и ускорить проведение отбора путем исключения операций по подготовке образца к анализу, уменьшить время экстракции. Способ не требует использования аналитических реагентов и проведения количественной экстракции, так как основан на качественных различиях в поглощении экстракта.

Способ прост в техническом исполнении и может быть использован для экспресс-диагностики ценных селекционных форм кукурузы на основе эндоспермовых мутаций различного типа. (56) Палий А. Ф. Генетические аспекты улучшения качества зерна кукурузы. Кишинев: Штиинца, 1989, с. 95.

Esen A. Cer. Chem. , 1980, vol. 57, N 2, p. 129-132
Misra P. S. , Barba-Ho R. , Mertz E. T. Cer. Chem. , 1973. vol. 50, N 2, р. 184-190.

Phodes A. P. , B jarnason M. , Pollmer W. G. J. Agric Food Chem. , 1979, vol. 27, N 6, р. 1266-1270.

Использование: биохимия, селекция кукурузы. Сущность изобретения: селекционно ценные эндоспермовые мутанты кукурузы идентифицируют по превышению значения отношения оптических плотностей, измеренных при определенных длинах волн, по сравнению со средним значением данного показателя у исследуемых сортообразцов. 4 табл.

СПОСОБ ОТБОРА ЭНДОСПЕРМОВЫХ МУТАНТОВ КУКУРУЗЫ С УЛУЧШЕННЫМ КАЧЕСТВОМ ЗЕРНА, включающий экстракцию размолотого зерна исследуемых образцов водным раствором спирта, определение значений оптической плотности экстрактов и идентификации селекционно ценных эндоспермовых мутантов по изменению значений оптической плотности их экстрактов, по сравнению со средним, отличающийся тем, что экстракцию проводят водным раствором изопропанола объемной концентрации 40 - 80% , определяют значения оптической плотности экстрактов при 315 и 260 нм, рассчитывают соотношение значений данных показателей и по его превышению в 1,3 - 1,7 раза по сравнению со средним идентифицируют эндоспермовые мутанты.