СПОСОБ ОТБОРА МУТАНТНЫХ ФОРМ КУКУРУЗЫ С УЛУЧШЕННЫМ КАЧЕСТВОМ БЕЛКА Российский патент 1994 года по МПК A01H1/04 

Изобретение относится к биотехнологии и сельскому хозяйству, в частности к генетическим исследованиям злаковых культур, и может быть использовано в селекционной практике для отбора хозяйственно ценных форм кукурузы с повышенной биологической ценностью зерна.

Зерно кукурузы как одной из основных зернофуражных культур несбалансировано по белковому составу. Поэтому для ухудшения биологической ценности зерна кукурузы в качестве доноров хозяйственно ценных признаков используют мутантные аналоги, обладающие сбалансированным составом белкового комплекса. В связи с этим для массовой оценки селекционного материала необходимы тест-способы оценки зерна на качество белка.

Согласно известным способам отбор форм кукурузы с улучшенным качеством белка проводят путем определения относительной доли спирторастворимых белков к незеиновым белкам, обладающим повышенной питательной ценностью [1] или к общему азоту зерна [2,3] . В качестве одного из показателей для отбора может также использоваться отношение содержания азота в зерне после экстракции водонасыщенным бутанолом к общему азоту зерна [4] . Учитывая отрицательную зависимость между накоплением зеина и лизина в зерне, в качестве маркерного признака используют снижение содержания проламина, определенное в воднобутанольном экстракте по методу с использованием красителя [5] .

К основным недостаткам указанных способов следует отнести трудоемкость и длительность операций по количественному выделению белка, а также проведение анализа с использованием специфичных реагентов.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту является способ, включающий обработку размолотого зерна изопропиловым спиртом в щелочной среде и проведение отбора по величине оптической плотности раствора после обработки биуретовым реагентом [6] .

Согласно способа навеску (800 мг) размолотого образца (целое зерно или эндосперм) суспендируют в изопропаноле, прибавляют карбонат меди и раствор едкого кали в изопропаноле. Смесь встряхивают 15 мин, а затем выдерживают 15 мин для формирования окраски. Окрашенный раствор фильтруют и измеряют оптическую плотность при 550 нм. Отбор мутантных форм кукурузы с улучшенным качеством проводят по уменьшению величины оптической плотности, отнесенной к общему содержанию белка в зерне, в сравнении с обычными аналогами.

Основным недостатком способа при проведении экспресс-оценки селекционного материала на качество зерна является необходимость предварительного обезжиривания образца, а также количественное определение белка с использованием набора реагентов.

Целью предлагаемого изобретения является упрощение и ускорение способа.

Способ осуществляется следующим образом.

Равные навески размолотого зерна обычных и мутантных форм кукурузы экстрагируют водным изопропанолом при объемной концентрации 30-90% . Экстракт отделяют фильтрованием, прибавляют раствор едкого натра до конечной концентрации 0,015-0,15% и измеряют оптическую плотность полученного раствора при 365 нм на спектрофотометре. Мутантные формы кукурузы с улучшенным качеством белка определяют по возрастанию величины оптической плотности в 1,3-2,0 раза в сравнении с обычными аналогами.

Значение аналитической длины волны (365 нм) определено экспериментально и соответствует максимуму поглощения экстракта.

В качестве форм кукурузы с улучшенным качеством белка использованы эндоспермовые мутанты типа о2/o2, o2/o2su2/su2 с установленными характеристиками.

Отличительной особенностью способа является использование в качестве маркерного признака для отбора величины оптической плотности в максимуме поглощения водноспиртового экстракта зерна в щелочной среде.

По указанным отличительным признакам был проведен патентный поиск. Аналогичных решений не обнаружено, поэтому указанные признаки являются существенными.

П р и м е р 1. Равные навески (по 50 мг) размолотого зерна обычной (А 204 +/+) и мутантной (А 204 о2/о2) кукурузы постоянно встряхивают с равными объемами (по 5 мл) водного изопропилового спирта различной концентрации (10-90% по объему) при комнатной температуре в течение 5 мин, фильтруют смесь, к экстракту прибавляют 0,1 мл 1 н. раствора едкого натра (конечная концентрация - 0,15% ) и встряхивают перед измерением. Оптическую плотность раствора измеряют при 365 нм на спектрофотометре Спекорд М - 40 в 1 см кювете и для оценки различий рассчитывают отношение измеренных величин мутантной и исходной форм. Результаты определения оптических плотностей экстрактов, полученных при различных концентрациях водного изопропанола, приведены в табл. 1 (данные статически достоверны, ошибка измерения не более 5% ).

Полученные результаты показывают, что концентрации водного изопропанола 30-90% являются оптимальным интервалом, при котором величина оптической плотности для мутантной формы с улучшенным качеством белка превышена в 1,3-1,6 раза в сравнении с обычным аналогом. При концентрациях 10 и 20% водного изопропанола установлены различия в 45 и 34% соответственно, однако при низких значениях оптической плотности возрастает ошибка измерения.

П р и м е р 2. Аналогично примеру 1 проводят определение оптической плотности при 365 нм экстрактов исходной (А 204 +/+) и мутантной (А 204 о2/о2) кукурузы с использованием 50% водного изопропанола при различных концентрациях едкого натра (табл. 2).

На основании полученных результатов следует сделать вывод о том, что оптимальный интервал конечной концентрации едкого натра (0,015-0,15% ) обеспечивает превышение показателя для мутантной формы в 1,5-1,7 раза. При концентрации щелочи ниже 0,015% стандартный и исследуемый образцы различаются всего на 7% , а возрастание содержания щелочи выше 0,15% снижает контрастность различий.

П р и м е р 3. Аналогично примеру 1 проводят отбор форм кукурузы с улучшенным качеством белка (W 155 o2/o2, wf9 o2/o2) в сравнении с обычными аналогами (50% изопропанол; конечная концентрация едкого натра - 0,15% ) (табл. 3).

П р и м е р 4. Аналогично примеру 1 проводят отбор форм кукурузы со сбалансированным составом белкового комплекса среди эндоспермовых мутантов типа o2, wx, o2/su2 на основе линий Cr 2 и А 619 (50% изопропанол; конечная концентрация едкого натра 0,15% ) (табл. 4). Значения оптической плотности при 365 нм для мутантных форм типа о2 и о2/su2 повышены в 1,4-1,7 раза в сравнении с обычными аналогами, тогда как величина показателя, установленная для линии Cr2wx/wx подтверждает, что мутация типа wx, изменяющая углеводный состав зерна, не влияет на качественный состав белкового комплекса.

П р и м е р 5. Определяют значения сравнительного показателя аналогично примеру 1 (50% изопропанол; конечная концентрация едкого натра 0,15% ) для эндоспермовых мутантов типа о2/su2 на основе различных обычных аналогов. В качестве показателя контрольного образца используют усредненное значение D₃₆₅^ср= 0,57 для исходных линий А 204, w 155, wf 9, Cr 2 и А 619 (примеры 2-4) (табл. 5).

Использование предлагаемого способа в сравнении с прототипом позволит упростить и ускорить проведение отбора за счет исключения подготовки образца к анализу, не требует применения аналитических реагентов и существенно уменьшает количество анализируемого селекционного материала.

Способ позволяет проводить экспресс-отбор эндоспермовых мутантов различного типа, используемых в селекционной практике для создания форм кукурузы с улучшенным качеством белка. (56) 1. Esen A. //J. Agric Food Chem. , 1980, v. 28, n. 3, p. 529-532.

2. Dalby A. //Cer. Chem. , 1974, v. 51, n. 5, p. 586-592.

3. Jones R. A. et al. //Cer. Chem. , 1975, v. 52, n. 2, p. 279-282.

4. Frombero H. K. et. al. //Crop Sci. , 1971, v. 11, n. 4, p. 567-569.

5. Esen A. //Cer. Chem. , 1980, v. 57, n. 2, p. 129-132.

6. Nisra P. S. et al. //Cer. Chem. , 1973. v. 50, n. 2, p. 184-190.

Использование: биотехнология, сельское хозяйство, селекционно-генетические исследования, биохимическая генетика. Сущность изобретения: мутантные формы кукурузы отбирают путем определения значения оптической плотности белкового экстракта размолотого зерна изопропанолом в щелочной среде при 365 нм и идентифицируют превышению у них данного показателя над таковым у немутантных в 1,3 - 2,0 раза. 5 табл.

СПОСОБ ОТБОРА МУТАНТНЫХ ФОРМ КУКУРУЗЫ С УЛУЧШЕННЫМ КАЧЕСТВОМ БЕЛКА, включающий экстракцию белков размолотого зерна исследуемых образцов водным изопропанолом в присутствии щелочи, определение значения оптической плотности экстракта и идентификацию по данному показателю мутантных и немутантных форм, отличающийся тем, что экстракцию осуществляют при объемной концентрации водного изопропанола 30 - 90% в присутствии едкого натра, конечную концентрацию которого доводят до 0,015 - 0,15% , определяют значение оптической плотности при 365 нм и мутантные формы идентифицируют по превышению у них данного показателя по сравнению с немутантными в 1,3 - 2,0 раза.