СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СПЕЦИФИЧНОСТИ ЭНДОСПЕРМОВЫХ МУТАНТОВ КУКУРУЗЫ К НАКОПЛЕНИЮ КАРОТИНОИДОВ Российский патент 1994 года по МПК A01H1/04 

Изобретение относится к биотехнологии, сельскому хозяйству, в частности к генетическим исследованиям зерновых культур, и может быть использовано в селекции и семеноводстве для отбора форм кукурузы с улучшенным качеством зерна.

Селекционные программы по улучшению качества зерна кукурузы включают использование эндоспермовых мутаций, изменяющих сбалансированность белкового комплекса. Для биологической ценности зерна является важным также оптимальное накопление каротиноидов, содержание которых изменяется под действием эндоспермовых мутаций. Для решения этой важной для селекции проблемы необходимы способы экспресс-диагностики, определяющие специфичность накопления каротиноидов в зерне эндоспермовых мутантов кукурузы.

Известные способы оценки воздействия эндоспермовых мутаций на каротиноидный комплекс зерна кукурузы включают экстракцию пигментов органическим растворителем, хроматографическое разделение экстракта на основные каротиноидные фракции, их идентификацию и количественное определение. К основным недостаткам указанных способов следует отнести их длительность и трудоемкость, необходимость использования набора химических реагентов и хроматографических сорбентов.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту является способ, включающий выделение и количественное определение каротиноидов по величине оптической плотности экстракта.

Согласно способа навеску размолотого зерна кукурузы экстрагируют водонасыщенным бутанолом при постоянном встряхивании в течение 25 мин. Экстракт каротиноидов отделяют фильтрованием и измеряют оптическую плотность окрашенного раствора на спектрофотометре при 435,8 нм. С использованием известного коэффициента экстинктции по величине оптической плотности рассчитывают содержание каротиноидов, которое используют для оценки селекционного материала.

Основными недостатками способа является необходимость проведения количественной экстракции каротиноидов с использованием токсичного бутанола и предварительной подготовки органического растворителя, большое количество селекционного материала, требуемого для анализа, что существенно ограничивает применение указанного способа для экспресс-диагностики.

Целью предлагаемого изобретения является упрощение и ускорение способа.

Способ осуществляется следующим образом.

Определяют оптическую плотность отражения среза зерновок или размолотого зерна кукурузы на денситометре ДО-1М (синий светофильтр, интервал пропускания 425-454 нм). Отбор высококаротиноидных мутантных форм проводят по максимальному значению спектрального показателя среди анализируемых селекционных образцов.

Интервал длин волн, используемый для анализа, выбран на основании спектральных характеристик каротиноидов и соответствует оптическим параметрам светофильтра.

Отличительной особенностью способа является использование в качестве образца среза зерновки или размолотого зерна кукурузы и проведение отбора по величине оптической плотности отражения.

П р и м е р 1. Измеряют оптическую плотность отражения среза 5 индивидуальных зерновых исходных (+/+) и мутантных по гену опейк-2 (o2/o2) линий кукурузы на денситомере ДО-1М (синий светофильтр, интервал пропускания 425-454 нм). Параллельно проводят определение содержания каротиноидов в анализируемых образцах известным способом. Полученные данные (табл. 1) показывают генотипическую специфичность воздействия мутации типа о2 на накопление каротиноидов в зерне.

Так, исходные линии А 204 (+/+) и Cг 2 (+/+) близки по величине оптической плотности отражения, что соответствует содержанию каротиноидов. Однако введение в генотип мутантного гена о2 в большей степени снижает содержание каротиноидов для линии Cг o2/o2 в сравнении с линией А 204 o2/o2, что подтверждается величиной спектрального параметра.

П р и м е р 2. Аналогично примеру 1 измеряют оптическую плотность отражения размолотого зерна и определяют специфичность воздействия мутаций типа о2, su 2, o2 su 2 на исходный генотип (линия W 64 А) (табл. 2).

Установленные величины оптической плотности показывают, что опейковая мутация приводит к значительному снижению накопления каротиноидов, тогда как в случае мутаций типа su2 и o2su2 снижение указанного показателя в сравнении с исходной формой незначительно.

П р и м е р 3. Аналогично примеру 1 измеряют спектральный параметр отражения размолотого зерна, определяют специфичность двойных эндоспермовых мутантов o2/o2 su2/su2 на основе различных исходных генотипов к накоплению каротиноидов и проводят отбор линии А 619 o2/o2 su2/su2 с повышенным содержанием каротиноидов в ряду анализируемых мутантных форм (табл. 3).

П р и м е р 4. Аналогично примеру 1 проводят определение оптической плотности размолотого зерна гетерогенного селекционного материала, в качестве которого использованы семь третьего года самоопыления (S₃), полученные во ВНИИ кукурузы из 16 линейных синтетиков кукурузы, содержащих в своем генотипе мутантный ген опейк-2 (табл. 4).

Анализ полученных данных показывает, что селекционным образцам с повышенным содержанием каротиноидов (2,00-2,40 мг% ) в ряду исследуемых синтетиков соответствует величина оптической плотности отражения размолотого зерна в интервале 0,37-0,45.

П р и м е р 5. Аналогично примеру 1 измеряют оптическую плотность отражения размолотого зерна высоколизиновых гибридов кукурузы на основе мутации опейк-2 и выявляют гибрид Днепровский 385 ВЛ, для которого максимальное значение спектрального параметра соответствует повышенному содержанию каротиноидов (табл. 5).

Использование предлагаемого способа в сравнении с прототипом позволит существенно упростить и ускорить проведение отбора путем исключения экстракции каротиноидов и использования химических реагентов. На основании установленного спектрального параметра возможен вариант неразрушающего позернового экспресс-отбора, что дает возможность сохранить высококаротиноидные зерновки перспективных форм для селекционно-генетических исследований. Процесс селекционной диагностики с применением маркерного признака идентифицирует генотипы с повышенным содержанием каротиноидов среди однотипных мутаций, определяет генотипическую вариабельность данного признака для эндоспермовых мутаций различной природы, а также их сочетаний, выявляет перспективные селекционные формы среди синтетиков и высоколизиновых гибридов кукурузы.

Способ позволяет выделить селекционные формы на основе эндоспермовых мутантов, в которых сбалансированность белкового комплекса зерна оптимально сочетается с содержанием каротиноидов и, таким образом, проводить экспресс-отбор по комплексу хозяйственно ценных признаков в процессе реализации селекционных программ на улучшение качества зерна кукурузы. (56) Grogan C. D. , Blessin C. W. Crop Science, 1968, vol. 8, N 6, р. 730-732.

Neamtu G. , Cabulea I. , Botez C. , Illyes G. , Irimie F. Stud. Cercet. Bioсhim. , 1984, t. 27, nr. 1, р. 63-69.

Методы оценки технологических качеств зерна, М. , 1971, с. 100-101.

Использование: сельское хозяйство, селекционно-генетические исследования, семеноводство. Сущность изобретения: специфичность мутантов кукурузы к накоплению каратиноидов определяют путем измерения оптической плотности отображения образца зерна, при этом максимальное накопление каратиноидов устанавливают при максимальном значении оптической плотности. 5 табл.

1. СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СПЕЦИФИЧНОСТИ ЭНДОСПЕРМОВЫХ МУТАНТОВ КУКУРУЗЫ К НАКОПЛЕНИЮ КАРОТИНОИДОВ, включающий измерение спектрального параметра образца, отличающийся тем, что при измерении спектрального параметра определяют оптическую плотность отражения образца зерна в области 425-454 нм и максимальное накопление каротиноидов у мутантных форм устанавливают по максимальному значению оптической плотности. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве образца используют срез зерна или размолотое зерно кукурузы.