Способ отбора высокотриптофановых генотипов кукурузы Советский патент 1992 года по МПК A01H1/04 

Изобретение относится к биотехнологии, к генетическим исследованиям зерновых культур и может быть использовано в селекции и семеноводстве для отбора перспективных форм кукурузы с улучшенным качеством зерна.

Кукуруза является одной из основных зернофуражных и пищевых культур. Однако, наряду с высокой продуктивностью кукурузы, ее зерно отличается несбалансированностью аминокислотного состава. Одним из показателей, снижающих питательную ценность зерна кукурузы, является низкое содержание триптофана. В связи с этим большую практическую значимость приобрели селекционно-генетические приемы улучшения качества зерна кукурузы путем повышения содержания

триптофана 1. С решением этой важной задачи неразрывно связана разработка способов отбора перспективных селекционных форм кукурузы с повышенным содержанием триптофана в зерне.

Известны способы отбора, включающие проведение щелочного или ферментативного гидролиза ооразца муки, обработку полученного гидролизата цветореагентом, измерение оптической плотности окрашенного раствора, определение количественного содержания триптофана по калибровочной зависимости и проведение отбора форм кукурузы с улучшенным качеством зерна в сравнении с контролем 2.

Недостатки указанных способов - длительность процедуры гидролиза образца муки, трудоемкость проведения анализа с

Х|

N

сь

XI О

использованием большого набора дефицитных и токсичных химических реагентов.

Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому эффекту является способ, включающий гидролиз образца муки под действием проназы, обработку гидролизата раствором п-диме- тиламинобензальдегида, измерение оптической плотности окрашенного комплекса с последующим отбором высокотриптофэно- вых образцов по результатам анализа.

Согласно способу навеску образца муки (500 мг) смешивают с суспензией фермента проназы при рН 7.4 (значение рН поддерживают прибавлением насыщенного раствора бикарбоната натрия). Гидролиз проводят в течение 48 ч при 37-39°С в термостате параллельно для анализируемого, контрольного образцов и суспензии фермента (контроль фермента). Гидролизаты охлаждают и центрифугируют в течение 30 мин, К пробе гидролизата прибавляют 5%- ный раствор п-диметиламинобензальдеги- да в концентрированной соляной кислоте. 1 %-ный раствор нитрита натрия и выдерживают 15 мин. Окрашенные растворы фильтруют и определяют оптическую плотность на фотометре для исследуемого образца, контроля образца и контроля фермента. Количественное содержание определяют по калибровочной зависимости, полученной путем анализа стандартных растворов триптофана. Отбор высокотриптофановых форм кукурузы проводят в сравнении с контрольным образцом зерна 3.

Недостатки известного способа-длитель- нссть проведения гидролиза образца муки (2 суг). необходимость поддержания в процессе гидролиза установленной температуры и величины рН, использование в процессе анализа растворов реагентов в концентрированной соляной кислоте, что существенно ограничивает применение способа для массовой оценки селекционного материала и не дает возможности проведения экспресс-диагностики.

Целью изобретения является упрощение и ускорение отбора.

Способ осуществляется следующим образом.

Срез зерна или муку образца кукурузы помещают в кювету спектрофлуориметра, облучают ультрафиолетовым светом при длине волны 270-285 им, измеряют спектр флуоресценции образца в области 290-360 нм и определяют положение максимума флуоресценции. При положении максимума в интервале длин волн 326-330 нм проводят отбор высокотриптофановых образцов кукурузы.

Интервал значений длин волн возбуждения (270-285 нм) и флуоресценции (326- 330 нм) обоснован экспериментально

Отличительной особенностью способа

является использование в качестве образца среза зерна или размолотого зерна кукурузы и проведение отбора по флуоресцентным параметрам образца.

Пример 1. Срез зерна кукурузы

0 помещают в кювету спектрофлуориметра МРФ-4, облучают его ультрафиолетовым светом при длине волны 281 нм, измеряют спектр флуоресценции образца в области 290-360 нм и определяют положение макси5 муг/i флуоресценции по результатам анализа 3-5 индивидуальных зерновок каждого сортообразцэ В качестве контрольных образцов используют зерно исходных линий кукурузы (+/+), а в качестве высокотрипто0 фановых - зерно линий кукурузы, мутантной по гену опейк - 2 (о2/о2). Параллельно проводят определение триптофана в зерне известным способом. Полученные данные свидетельствуют о том, что для контрольных

5 образцов максимум флуоресценции находится при 314-315 нм, тогда как установленные значения для высокотриптофановых аналогов достоверно выше и характеризуются интервалом 326-329 нм.

0 В табл.1 приведены значения максимумов флуоресценции срезов зерна и содержание триптофана в зерне контрольных и высокотриптофановых образцов кукурузы. Пример 2. Аналогично примеру 1

5 проводят определение максимума флуоресценции размолотого зерна кукурузы при различных значениях длины волны возбуждения для контрольного (W155 +/+) и высо- котриптофанового (W155 о2/о2) образцов.

0 В результате эксперимента установлено, что оптимальным интервалом, при котором возможен достоверный отбор высокотриптофановых аналогов, является область длин волн возбуждения 270-285 нм.

5 При значениях длины волны возбуждения меньше 270 нм уменьшается точность определения максимума флуоресценции из-за снижения его интенсивности, а при значениях длины волны возбуждения выше 285

0 нм уменьшаются различия между параметром контрольного и высокотриптофанового образцов и, тем самым, снижается достоверность отбора.

В табл.2 приведены данные о зависимо5 сти флуоресценции размолотого зерна кон-- трольныхи высокотриптофановых образцов кукурузы от длины возбуждения.

Пример 3. Аналогично примеру 1 проводят определение максимума флуоресценции образцов размолотого зерна кукурузы исходной линии W64 А +/+ и эндоспер- мовых мутантов типа о2/о2, su2/su2, o2/o2 su2/su2 при длине волны возбуждения 281 нм. Установленные значения максимума флуоресценции (табл.3) показывают сте- пень влияния различных эндоспермовых мутаций на изменение триптофана в зерне.

Пример 4. Аналогично примеру 1 проводят измерение при длине волны возбуждения 281 нм и устанавливают вариа- бельность максимума флуоресценции для срезов зерна исходной линии кукурузы Сг 2 +/+ и эндоспермовых мутантов типа о2/о2, wx/wx, o2/o2 wx/wx. Результаты даны в табл.4.

Пример 5. Аналогично примеру 1 определяют значения максимума флуоресценции при длине волны возбуждения 281 нм и проводят оценку высокотриптофано- вых образцов муки двойных мутантов типа о2/о2 su2/su2 на основе различных исходных генотипов кукурузы.

В табл.5 приведены значения максимумов флуоресценции размолотого зерна эндоспермовых мутантов кукурузы.

Пример 6. Аналогично примеру 1 проводят определение максимума флуоресценции при длине волны возбуждения 281 нм для срезов зерна гетерогенного селекци- онного материала. В данном случае использованы семьи третьего года самоопыления (Зз), которые получены во ВНИИ кукурузы из 16 линейных синтетиков кукурузы, содержащих в своем генотипе мутант- ный ген опейк-2. Полученные результаты приведены в табл.6 и показывают возможность проведения диагностики высокотрип- тофановых форм на гетерогенном селекционном материале.

Использование предлагаемого способа в сравнении с прототипом позволит существенно упростить и ускорить проведение отбора путем исключения длительных и трудоемких операций по оценке содержания триптофана в зерне. При этом предлагаемый способ полностью исключает использование химических реагентов.

Установочный маркерный признак дает возможность проводить позерновочный экспресс-анализ без разрушения зерновки, что является важным при диагностике селекционного материала с ограниченным выходом зерна. Проведение отбора с использованием параметров флуоресценции позволит выявить высокотриптофано- вые формы при генотипической вариабельности воздействия различных эндоспермовых мутаций, а также при практической селекции кукурузы с улучшенным качеством зерна.

Формула изобретения

1.Способ отбора высокотриптофановых генотипов кукурузы, включающий определение оптических параметров исследуемых образцов и идентификацию высокотриптофановых форм, отличающийся тем, что, с целью упрощения и ускорения отбора, исследуемые образцы предварительно облучают ультрафиолетовым светом при длине волны 270-285 нм, в качестве оптического параметра определяют спектр флуоресценции при длине волны 290-360 нм, находят максимум флуоресценции и по его положению в интервале длин волн 326-330 нм идентифицируют высокотриптофановые формы.

2.Способ по п.1,отличающийся тем, что в качестве исследуемых образцов используют срезы зерна или размолотое зерно кукурузы.

Таблица 1

Использование: биотехнология, сельское хозяйство, биохимия растений, селекция и семеноводство. Сущность изобретения: облучают исследуемый образец зерна кукурузы ультрафиолетовым светом, определяют спектр флуоресценции, находят максимум флуоресценции и по его положению в интервале длин волн 326-330 нм идентифицируют высокотриптофановые формы. 1 з.п.ф-лы, 6 табл. (Л С

Генотип кукурузы

Контрольные образцы

А204+/+

W 64 А +/+

W 155+/+

Wf 6 +/+

ысокотриптофановые образцы

А204о2/о2

W64Ao2/o2

W155o2/o2

Wf 9o2/o2

Ямакс ,НМ

Содержание триптофана, % на сухую массу

0,074 0,080 0,097 0,095

0,118 0,121 0,115 0,135

Таблица 2

Таблица 3

Таблица 5

Продолжение табл. 6