Способ выявления эндоспермовых мутаций кукурузы Советский патент 1992 года по МПК A01H1/04 

(Л

С

Использование: биотехнология, сельское хозяйство, селекция и семеноводство. Сущность изобретения: экстрагируют кара- тиноидный комплекс зерна, измеряют спектр поглощения раствора в области 350- 600 нм, находят значения оптической плотности в максимумах при 445-450 и 368-370 нм и рассчитывают их отношение. По уменьшению рассчитанного отношения у исследуемых форм по сравнению с исходной формой выявляютэндоспермовую мутацию. 1 ил., 1 табл.

Изобретение относится к биотехнологии и сельскому хозяйству, в частности к генетическим исследованиям зерновых культур, и может быть использовано в селекционной практике для отбора перспективных форм кукурузы с хозяйственно ценными признаками.

Генетические приемы, используемые в селекционной практике, позволяют улучшать качество зерна кукурузы. Одним из показателей, определяющих биологическую ценность, является содержание и качественный состав каротиноидного комплекса зерна. В связи с этим возникает необходимость разработки способов определения влияния эн- доспермовых мутаций на каротиноидный комплекс как показатель качества зерна.

Известный способ выявления эндос- пермовых мутаций включает выделение и количественное определение каротина в зерне. При этом степень воздействия мутации на исходный генотип выявляют по изменению суммарного содержания каротина.

К недостатку способа следует отнести то, что сравниваемый показатель отражает только количественное накопление кароти- ноидов и не дает возможности оценить вли- яние эндоспермовой мутации на качественный состав каротиноидного комплекса.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту является способ, включающий выделение каротиноидного комплекса зерна кукурузы, разделение на основные каротиноидные фракции и определение их относительного содержания.

Согласно способу навеску целого зерна кукурузы (50 г) дважды экстрагируют диэти- ловым эфиром для удаления восковой оболочки, высушивают и размалывают. Навеску муки встряхивают со смесью абсолютного этанола, воды и 60% едкого натра в течение

VI GJ

О СЛ

10 мин при 50°С, Воздух над образцом уда ляют пропусканием газообразного азота, Образец выдерживают при комнатной температуре в темноте 16 ч с последующим встряхиванием при 50°С в течение 10 мин, Растворитель удаляют центрифугированием. Остаток экстрагируют трижды абсолютным этанолом по описанной процедуре. Экстракты объединяют и упаривают до объема 100 мл на роторном испарителе. Затем к смеси добавляют 200-300 мл воды и проводят полную экстракцию каротиноидов порциями дизтипового зфира по 100 мл. Остаточные количества едкого натра удаляют из объединенных экстрактов последовательным промыванием водой с использованием фенолфталеина для контроля присутствия щелочи в водной фазе. После высушивания над безводным сульфатом натрия диэтиловый эфир удаляют на роторном испарителе. Остаток растворяют в гекса- не для проведения хроматографии, Для разделения каротиноидных фракций используется хроматографическая колонка, наполненная слоем адсорбента и безводного сульфата натрия. После нанесения каро- таноидной смеси на колонку под вакуумом колонка обрабатывается сухим азотом, Основные каротиноидные фракции {каротины, зеиноксантин,криптоксантин, люте- ин, зеаксантин, полиоксисоединекия) последовательно злюируются из колонки органическим растворителем.

Идентификацию каротиноидных фракций проводят с использованием спектров поглощения. Количественное содержание рассчитывают по величине оптической плотности при аналитических длинах волн, используя известные коэффициенты экс- тинкции для каждой каротиноидной фракции, Относительное содержание основных каротиноидных фракций определяют как процент от суммарного содержания каротиноидов и используют в качестве показателя для сравнения изменений состава кароти- ноидного комплекса селекционных образцов кукурузы.

Основными недостатками способа является его длительность и трудоемкость. Например, исчерпывающее выделение каротиноидов проводится путем экстракции растворителем в течение 64 ч (четыре стадии по 16 ч). Способ включает в себя трудоемкие операции по хроматографическому разделению каротиноидных фракций, необходимость работы с газообразным азотом, вакуумирование образцов, предварительную подготовку образца зерна к анализу, абсолютирование этанола и т.д. Длительная и трудоемкая методика позволяет провести

анализ образца за несколько суток, требует большого количество селекционного материала и расхода химических реактивов, дефицитных хроматографических сорбентов,

что существенно ограничивает практическое использование указанного способа в селекционной практике.

Цель изобретения - упрощение и ускорение способа.

Способ осуществляют следующим образом.

Проводят экстракцию каротиноидного комплекса смесью ацетон - гексан (1:1 по объему) из размолотого зерна кукурузы параллельно для исходного и исследуемого образцов, Раствор каротиноидов отделяют фильтрованием. Измеряют спектр поглощения раствора в области 350-600 нм, находят значения оптической плотности з максимумах поглощения при 445-450 и 368-370 нм и рассчитывают соотношение оптических плотностей при указанных максимумах в качестве сравнительного показателя, Эндос- пермовую мутацию выявляют по

уменьшению величины сравнительного показателя по отношению к исходной форме. Из чертеже приведены спектры поглощения каротиноидного комплекса исходной (кривая 1-+/+J и мутантных (кривая 2 о2/о ; кривая 3- su2/su2; кривая 4-о2/о2 su2/su2) форм кукурузы (линия W 64A).

интервал значений длин волн 368-370 нм ( /h ) и 445-450 нг f fa) обоснован экспериментально, При этом соотношение оптических плотностей является маркерным признаком для максимумов поглощения при указанных длинах волн.

Отличительными особенностями способа являются анализ по спектру поглощения

раствора каротиноидного комплекса зерна и выявление эндоспермовых мутаций го соотношению оптических плотностей в максимумах поглощения.

Пример. Проводят экстракцию каротиноидного комплекса из образца размолотого зерна кукурузы (1,5 г) смесью ацетон - гексан (1:1 пообьему)(5мл) э течение 1 ч при комнатной температуре с периодическим перемешиванием. Экстракцию проводят

параллельно для исходного и исследуемого образцов. Раствор каротиноидов отделяют фильтрованием. Измеряют спектр поглощения раствора а области, 350-600 нм на спектрофотометре Спекорд М40 в 1 см кювете.

По полученному спектру находят значения оптической плотности в максимумах поглощения 368-370 нм ( AI ) и 445-450 нм (fa } и рассчитывают соотношение оптической плотности при указанных максимумах для

сравнения (D2/Di). Результаты определения сравнительного показателя для кароти- ноидного комплекса зерна кукурузы с эндоспермовыми мутациями типа о2, su 2, wx, o2/o2 su2/su2, o2/o2 wx/wx приведены в таблице (данные статистически достоверны, ошибка измерения не более Б%.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что предлагаемый способ позволяет выявить эндоспермовые мутации кукурузы различного типа по снижению со.- отношения Da/D-t в спектрах поглощения каротиноидного компле/са зерна в сравнении с известным, a laxxe определить степень воздействия эьдоспермоуых мутаций на каротиноидныЛ комплекс зерна в зависимости от исходного генотипа. Например, для линии W 64А мутяция типа о2/о2 оказывает более заметное влияние на каротино- идный комплекс зерна з сравнении с мутацирми типе su2/su2 или о2/о2 su2/su2.

Результаты приведены а таблице.

Использование предлагаемого способа в сравнении с известным позволь упро- стить и ускорить проведение отбора путем исключения длительных и трудоемких операций, уменьшить количество анализируемого селекционного материала. При этом исчерпывающая экстракция каротиноидов

не является обязательной, так как предлагаемый маркерный признак связан с изменением качественного состава каротиноидов, проявляющимся в спектре поглощения.

Предлагаемый способ прост в техническом исполнении и позволяет существенно повысить интенсификацию селекционной диагностики для выявления сортообразцов кукурузы с хозййственно ценными признаками.

Формула изобретения Способ выявления эндоспермовых мутаций кукурузы, включающий выделение ка- ратиноидного комплекса зерна, измерение оптических параметров и определение наличия мутаций по изменению оптических параметров исследуемых форм в сравнении с исходной, отличающийся тем, что, с целью упрощения и ускорения способа, в качестве измеряемого оптического параметра исследуют спектр поглощения раствора каратиноидного комплекса в области 350-600 нм, определяют значения оптических плотностей в максимумах поглощения и о наличии мутаций судят по уменьшению отношения значения оптической плотности в максимуме при 445-450 нм к значению оптической плотности в максимуме при 368-370 нм.

я,

400

4500 ouu

Я, им