Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и защите растений, а именно к способу получения инсектицида на основе метаболитов энтомопатогенных грибов.
Известны способы получения биопрепаратов для защиты растений от сосущих вредных насекомых на основе метаболитного комплекса энтомофторовых грибов, в частности способ получения инсектицида путем экстракции токсинов из биомассы грибов p. Entomophthora хлороформом, выдерживание полученной смеси и отделения хлороформенной фазы, отличающийся тем, что с целью повышения выхода целевого продукта, перед экстракцией из биомассы выделяют фракцию, не обладающую инсектицидной активностью, с помощью диоксана.
Основной недостаток указанного способа - низкая активность токсичной фракции и низкий выход.
За прототип принят способ получения инсектицида из гриба Verficillium lecanii на основе живых спор. Однако эффективность полученного таким способом препарата ограничена относительной влажностью воздуха (80-97% ) и температурой (16-18оС ночью и 24-30оС днем). Кроме того, препарат быстро теряет активность при хранении.
Цель изобретения - увеличение биологической эффективности биопрепарата и удлинение срока хранения без ее потери.
В качестве продуцента биопрепарата используют гриб V. lecanii. В отличие от прототипа из биомассы энтомопатогенной гриба экстрагируют токсинсодержащую фракцию с предварительным извлечением фракции, не обладающей инсектицидной активностью, методом колоночной хроматографии. Это обеспечивает значительное увеличение выхода и активности биологического инсектицида. Поскольку эти признаки отсутствуют в прототипе, то предложенное решение соответствует критерию "новизна".
Сущность предложенного способа заключается в том, что на питательной среде выращивают биомассу гриба V. lecami, которую отделяют от среды и высушивают. Затем биомассу гриба экстрагируют хлороформом при соотношении 1: 5 - 1: 10 и проводят последовательное выделение фракций методом колоночной хроматографии с использованием силикагеля марки 40/100 производства ЧССР. Колонку набивали путем разбавления силикагеля гексаном.
П р и м е р 1. Гриб V. lecanii (шт. Р-81, деп. в кол. ВИЗР) выращивали на качалке в течение 6 сут при 28+2о на среде следующего состава: КН2РО4 - 2,0 г; MgSO4 - 1,0 г; пептон - 10,0 г; глюкоза - 20,0 г; Н2О - до 1 л. Биомассу отделяли фильтрованием; высушивали при 38-40о и размалывали.
Данные по подбору оптимального для экстракции соотношения биомассы и объема растворителя приведены в табл. 1. Данные таблицы свидетельствуют, что оптимальным является отношение биомассы к объему хлороформа 1: 5 - 1: 10. На основании полученных результатов было взято соотношение биомассы и растворителя 1: 5.
К 100 г воздушно-сухой биомассы добавляли 500 мл хлороформа, настаивали 24 ч. Раствор отделяли фильтрованием, растворитель упаривали под вакуумом на роторном испарителе при 40о. Экстракт (3,0 г) наносили на колонку с силикагелем высотой 40 см и внутренним диаметром 3 см, заполненную 180 г силикагеля в гексане сухим способом. Экстракт растворяли в 80 мл спирта, смешивали раствор с 20 г силикагеля, спирт упаривали, остаток наносили на колонку. Колонку мыли системой растворителей: гексан, хлороформ, спирт с постепенным увеличением полярности (табл. 2).
Контроль за разделением вели методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) на пластинах Silufol в системе толуол-этилацетат-муравьиная кислота 9: 2: 1 соответственно, вещества обнаруживали парами йода. Фракции, одинаковые по содержанию веществ и Rf, объединяли. С целью предварительного изучения состава фракций были испытаны общие и специфические обнаружители для липидов. Анализ липидов проводили путем опрыскивания пластин проявляющими реагентами непосредственно (Кейтс. , 1975) после разделения фракций в указанной системе. Анализ липидов показал, что при делении исходного хлороформного экстракта по предложенной схеме гексаном и хлороформом вымываются триглицериды, свободные жирные кислоты, нейтральные липиды (фракции 1 и 2), хлороформом - липиды промежуточной полярности: альдегиды, кетоны, сложные эфиры (фракции 3-26), смесью этанола с хлороформом - полярные липиды; фосфолипиды, гликолипиды, сульфолипиды и др. (фракции 27, 28, 29). Дальнейшую работу проводили с объединенными фракциями.
Таким образом были получены фракции 1, 2, 3, 6 объединенная (4-7), 12 объединенная (9-14), 15, 26 объединенная (16-26), 27 и 28 объединенная (28 и 29).
Инсектицидная активность полученных фракций была оценена на личинках старших возрастов и самках гороховой тли. Для этого в чашку Петри диаметром 40 мм помещали фильтры такого же диаметра, смоченные 0,3 мл 0,1-41,5% -ными растворами экстрактов, и подсаживали 20-30 особей насекомых. Учет гибели тлей проводили через 2 ч после выдерживания чашек при 28о. В контроле фильтры обрабатывали водой. Данные представлены в табл. 3.
Анализ данных табл. 3 показал, что описанный способ позволяет получать фракции общего экстракта V. lecanii, обогащенные инсектицидными веществами.
П р и м е р 2. Описанным по примеру 1 способом был получен образец биопрепарата, обогащенный токсином V. lecanii (фракции 26 объед. , 27,28 объед. ). Данные по содержанию токсина и инсектицидной активности в отношении гороховой тли по сравнению с прототипом представлены в табл. 4.
Данные таблицы свидетельствуют, что биопрепарат, полученный по предлагаемому способу, обладает значительно более высокой инсектицидной активностью в отношении гороховой три при увеличении выхода активной фракции в 100 раз.
П р и м е р 3. Описанным согласно примеру 1 способом был получен образец биопрепарата. Испытания эффективности в лабораторных условиях были проведены по указанной методике в отношении ряда вредных насекомых (табл. 5).
Для сравнения был взят биопрепарат, полученный на основе штамма Steptomysec aurantiacus (заявка N 449936/13), как наиболее активный в отношении комплекса сосущих вредных насекомых.
Данные таблицы свидетельствуют, что биопрепарат, полученный предлагаемым способом, обладает значительно более высокой активностью в отношении оранжерейной белокрылки, (эффективность 0,5% экстракта - 91,7% по сравнению с 68,1% в контроле) и персиковой тли. Гибель 60% тлей наблюдается при концентрации рабочей эмульсии 0,1% по сравнению с 0,5% в прототипе.
Высокую эффективность биопрепарат проявил в отношении гороховой и бахчевой тлей.
Таким образом, по предлагаемому способу выход токсической фракции многократно увеличивается по сравнению с прототипом при одновременном повышении биологической активности в отношении сосущих насекомых (27,6% в отношении персиковой тли и 25,7% в отношении белокрылки соответственно при 0,5% -ной концентрации рабочей эмульсии). (56) Авторское свидетельство СССР N 1396121, кл. А 01 N 63/00, 1983.
Использование: сельскохозяйственная микробиология, производство средств защиты растений от насекомых, в частности инсектицидов. Сущность изобретения: гриб Verticillium lecanii выращивают на питательной среде, содержащей источник углерода, азота и минеральные соли, отделяют полученную биомассу фильтрованием, высушивают и размалывают, проводят экстракцию инсектицидсодержаще вещество хлороформом в соотношении 1 : 5 - 1 : 10. Отделяют экстракт фильтрованием и очищают методом колоночной хроматографии с последовательным использованием системы растворителей: гексан-хлороформ в соотношении 1 : 1, хлороформ и 10% -ный этанол в хлороформе. 5 табл.
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНСЕКТИЦИДА путем культивирования гриба Verticillium lecanii с последующим отделением биомассы гриба и высушиванием ее, отличающийся тем, что из сухой биомассы экстрагируют инсектицидсодержащее вещество хлороформ при соотношении 1 : 5 - 1 : 10, полученный экстракт отделяют и очищают методом колоночной хромотографии, удаляя неактивные фракции с последовательным использованием системы растворителей: гексан - хлороформ в соотношении 1 : 1, хлороформ и 10% -ный этанол в хлороформе.
