ШТАММ ГРИБА ENTOMOPHTHORA THAXTERIANA N19-11 (ВИЗР) ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ БИОПРЕПАРАТА МИКОАФИДИН Т Российский патент 2000 года по МПК A01N63/04 C12N1/14 C12N1/14 C12R1/645 

Изобретение относится к области сельскохозяйственной микробиологии и может быть использовано при получении препарата микоафидин T для защиты растений от тлей, паутинных клещей и трипсов.

В качестве ближайшего аналога выбран штамм гриба Entomophthora thaxteriana Petch. N 18 (Zygomycetes: Enteromophthorales) (ВИЗР) (авт.св. N 1658432), являющийся продуцентом токсических веществ - основы биопрепаратов, однако в процессе сохранения и многократных пересевов данный штамм утратил свои токсинообразующие свойства и снизилась его биологическая эффективность по отношению к насекомым-вредителям.

Задача изобретения состоит в получении нового штамма гриба, обладающего более высоким (по сравнению с известным) уровнем образования токсических веществ и инсектицидной активностью против сосущих вредителей.

Штамм Entomophthora thaxteriana N 19-11 (ВИЗР) получен путем ступенчатого отбора из моноконидиального рассева природного изолята, выделенного из персиковой тли. Отбор проведен по признаку токсинообразования изолятов этого гриба при культивировании в глубинных условиях. Штамм Entomophthora thaxteriana депонирован в коллекции чистых культур ВИЗР под N 19-11. Выход микоафидина T у штамма составляет 2,5 - 2,6 г с 1 литра питательной среды, состоящей из 4% глюкозы, 1% соевой муки и воды (остальное). Содержание микоафидина T в биомассе 19,4 - 19,5%.

Морфологические признаки
Вегетативный мицелий штамма несептированный, бесцветный, распадающийся через 24 часа на короткие прямые или изогнутые гифенные тела. Образование конидиеносцев с конидиями происходит на субстратном мицелии.

Конидиеносцы короткие, бесцветные, неразветвленные, с одной конидией на конце.

Конидии сферические с сосочком у основания содержат одно крупное или несколько мелких жировых включений.

Размеры конидий 25 - 39 х 21 - 32 мкм, в среднем 32 х 26 мкм. Конидии имеют однослойную клеточную стенку, гладкую поверхность.

Формирование покоящихся спор начинается к 66 часам роста. Покоящиеся споры округлые с двойной оболочкой и крупной жировой каплей в центре. Размеры покоящихся спор 20 - 25 мкм, в среднем 22 мкм. Поверхность спор гладкая, клеточная стенка трехслойная.

Культурально морфологические признаки штамма изучены на сусло (50% неохмеленное пивное сусло), средах Сабуро (1% пептон и 4% глюкозы) и соевой (1% соевой муки и 4% глюкозы). На всех указанных средах штамм образует плоские, гладкие и бесцветные колонии, которые при 24-часовом освещении покрываются налетом конидий, что придает колониям белый цвет. Пигмент в среду не выделяется.

Характер поверхностного роста гладкий. Скорость роста колонии в стандартных условиях (pH 6,5 - 7,0; температура выращивания 22^oC) на сусло и среде Сабуро 3,0 мм/сутки, на соевой среде - 2,8 мм/сутки.

Выход микоафидина T для штамма E. thaxteriana N 18 составляет 4,99% или 0,35 г/л питательной среды соответственно.

Инсектицидную активность определяли экспресс-методом, описанным в "Методике испытаний микоафидина T в лабораторных, полевых и производственных условиях" (составители: Воронина Э.Г., Мукамолова Т.Ю. и др., Ленинград - Пушкин, 1988). Метод состоит в следующем: в чашку Петри диаметром 40 мм на фильтр, смоченный 0,3 мл раствора препарата, помещали тлей, учет гибели проводили через 1 час контакта с обработанной поверхностью, количество повторностей - 4 - 5 чашек, число насекомых в чашке 20 - 30 особей.

Эффективность действия препаратов на личинок табачного трипса определяли экспресс-методом, аналогичным для тлей. Обработку паутинных клещей проводят путем окунания листьев фасоли с клещами в 1% водную эмульсию препаратов. Листья затем помещают в чашки Петри с водой для предотвращения разбегания клещей, гибель учитывают через 24 часа.

В таблицах 1, 2 приведены инсектицидная активность и выход препаративных форм штаммов гриба E. thaxteriana N 18 и N 19-11.

Таким образом, штамм Entomophthora thaxteriana N 19-11 обладает повышенным уровнем токсинообразования и биологической эффективности, что позволяет снизить концентрацию рабочей эмульсии препарата, полученного на его основе, до 0,5% для достижения 90 - 100% гибели вредителей сельскохозяйственных культур в открытом и закрытом грунте.

Цвет
На агаризированных питательных средах (Сабуро, соевой и сусло) штамм образует бесцветные колонии. Пигмент в среду не выделяется. Хорошо спорулирующая колония имеет белый цвет за счет обильного белого налета из конидий.

Физиологические признаки
Пигмент не образуется и в среду не выделяется. Из источников углерода хорошо усваивает глюкозу, мальтозу, крахмал, фруктозу (на них отмечен наилучший рост и споруляция). На среде с аминокислотами может расти без углеродов за счет углеродной части аминокислот, однако рост слабый и споруляция отсутствует. Плохо растет и спорулирует на средах, содержащих сахарозу, лактозу, галактозу, арабинозу, ксилозу и спирты.

Из источников азота усваивает смеси аминокислот, пептиды, белки, может расти на средах с аспарагином. Нитратный азот не усваивает, на средах с аммонийным азотом - рост слабый.

Температура
Рост отмечался в диапазоне температур + 3 - 36^oC. Температурный оптимум для роста 27^oC, для конидиеобразования 20 - 22^oC.

Микроаэрофильный рост
Штамм является строгим аэробом.

Проверка жизнеспособности штамма осуществляется пересевом культуры на свежий сусло-агар с последующим выращиванием в термостате при 22^oC.

Способ сохранения
Продолжительность выращивания на косяках сусло-агара 7 - 8 суток, после чего штамм может храниться без пересевов 1 - 1,5 года.

Способ консервации
Штамм может храниться на косяках сусло-агара при +4^oC в течение 1 - 1,5 лет без пересева. В Госколлекции микроорганизмов ИБФМ АН России штамм хранится в жидком азоте 3 года без потери жизнеспособности.

Наличие маркерных признаков
Штамм продуцирует два вида эндотоксинов и обладает избирательным токсическим действием. Продуктивность E. thaxteriana N 19-11 по микоафидину T составляет 2,5 - 2,6 г/л среды, инсектицидная активность 98 - 100% в различных вариантах с тест-насекомыми. Уровень токсинообразования штамма является стабильным признаком: после 16 генераций токсигенность штамма и эффективность образцов препаратов остается на первоначальном уровне.

Пример. Штаммы E. thaxteriana N 18 и N 19-11 выращивают на среде, содержащей 1% соевой муки и 4% глюкозы, вода - остальное (pH 6,5 - 7,0) при 27^oC в течение 3 суток. Биомассу отфильтровывают, высушивают при температуре 37^oC (до воздушно-сухого состояния) и размалывают.

Выделение микоафидина T из 1 г биомассы проводят этанолом в течение 60 мин. Полученные растворы отделяют фильтрованием от биомассы и выпаривают спирт до полного его удаления.

Выход микоафидина T для штамма E. thaxteriana N 19-11 составляет 19,4% или 2,53 г/л питательной среды соответственно.

Изобретение относится к области сельскохозяйственной микробиологии и может быть использовано при получении препарата микоафидин Т для защиты растений от тлей, паутинных клещей и трипсов. Штамм Entomophthora thaxteriana 19-11 (ВИЗР) получают путем ступенчатого отбора из моноконидиального рассева природного изолята, выделенного из персиковой тли. Отбор проводят по признаку токсинообразования изолятов этого гриба при культивировании в глубинных условиях. Штамм Entomophthora thaxteriana депонирован в коллекции чистых культур ВИЗР под 19-11. Выход микоафидина Т у штамма составляет 2,5-2,6 г с 1 л питательной среды, состоящей из 4% глюкозы, 1% соевой муки и воды (остальное). Содержание микоафидина Т в биомассе 19,4-19,5%. Применение биопрепарата позволяет снизить концентрацию рабочей эмульсии препарата до 0,5%. Инсектицидная активность 90-100% гибели вредителей сельскохозяйственных культур в открытом и закрытом грунте. 2 табл.

Штамм гриба Entomophthora thaxteriana N 19-11 (ВИЗР) для получения биопрепарата микроафидин Т против сосущих насекомых-вредителей и клещей.