ШТАММ ГРИБА ENTOMOPHTHORA THAXTERIANA PETCH. (ZYGOMYCETES: ENTOMOPHTHORALES) N 19 (ВИЗР) ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ БИОПРЕПАРАТОВ Российский патент 2002 года по МПК A01N63/04 C12N1/14 C12N1/14 C12R1/645 

Изобретение относится к области сельскохозяйственной микробиологии и может быть использовано при получении препаратов для защиты растений от тлей, паутинных клещей и трипсов.

В качестве ближайшего прототипа выбран штамм гриба Entomophthora thaxteriana Petch. 18 (Zygomycetes; Entomophthorales) (ВИЗР) (А.С. 1658432), являющийся продуцентом токсических веществ - основы биопрепаратов, однако, в процессе сохранения и многократных пересевов данный штамм резко снизил токсинообразование, а также уменьшилась его биологическая эффективность по отношению к насекомым - вредителям.

Задача изобретения состоит в получении нового штамма гриба, обладающего более высоким (по сравнению с известным) уровнем образования токсических веществ и инсектицидной активностью, против сосущих вредителей. Штамм Entomophthora thaxteriana 19 (ВИЗР) получен путем ступенчатого отбора из моноконидиального рассева природного изолята, выделенного из персиковой тли. Отбор проведен по признаку токсинообразования изолятов этого гриба при культивировании в глубинных условиях. Штамм Entomophthora thaxteriana депонирован в коллекции чистых культур ВИЗР под 19. Выход микоафидина Т у штамма составляет 0.85 - 0.9 г, энтокса - 4.8 - 5.0 г с 1 л питательной среды, состоящей из 4% глюкозы, 1% соевой муки и воды (остальное). Содержание микоафидина Т в биомассе 6-6.2%, энтокса 34.0-34.9%.

МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ПРИЗНАКИ
Вегетативный мицелий штамма несептированный бесцветный, распадающийся через 24 ч на короткие прямые или изогнутые гифенные тела. Образование конидиеносцев с конидиями происходит на субстратном мицелии.

Конидиеносцы короткие, бесцветные, неразветвленные, с одной конидией на конце.

Конидии сферические с сосочком у основания содержат одно крупное или несколько мелких жировых включений.

Размеры конидий 25-39 х 21-32 мкм, в среднем 32 х 26 мкм. Конидии имеют однослойную клеточную стенку, гладкую поверхность.

Формирование покоящихся спор начинается к 66 часам роста. Покоящиеся споры округлые с двойной оболочкой и крупной жировой каплей в центре. Размеры покоящихся спор 20-25 мкм, в среднем 22 мкм. Поверхность спор гладкая, клеточная стенка трехслойная.

Культурально-морфологические признаки штамма изучены на сусло (50% неохмеленное пивное сусло), средах Сабуро (1% пептон и 4% глюкозы) и соевой (1% соевой муки и 4% глюкозы). На всех указанных средах штамм образует плоские, гладкие и бесцветные колонии, которые при 24 часовом освещении покрываются налетом конидий, что придает колониям белый цвет. Пигмент в среду не выделяется.

Характер поверхностного роста гладкий. Скорость роста колонии в стандартных условиях (рН 6.5-7.0, температура выращивания 22^oС) на сусло и среде Сабуро 3.0 мм сутки, на соевой среде - 2.8 мм сутки.

ЦВЕТ
На агаризированных питательных средах (Сабуро, соевой и сусло) штамм образует бесцветные колонии. Пигмент в среду не выделяется. Хорошо спорулирующая колония имеет белый цвет за счет обильного белого налета из конидий.

ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ПРИЗНАКИ
Пигмент не образуется и в среду не выделяется. Из источников углерода хорошо усваивает глюкозу, мальтозу, крахмал, фруктозу (на них отмечен наилучший рост и споруляция). На среде с аминокислотами может расти без углеводородов за счет углеродной части аминокислот, однако, рост слабый и споруляция отсутствует. Плохо растет и спорулирует на средах, содержащих сахарозу, лактозу, галактозу, арабинозу, ксилозу и спирты.

Из источников азота усваивает смеси аминокислот, пептиды, белки, может расти на средах с аспарагином. Нитратный азот не усваивает, на средах с аммонийным азотом - рост слабый.

ТЕМПЕРАТУРА
Рост отмечался в диапазоне температур 3-36^oС. Температурный оптимум для роста 27^oС для конидиеобразования 20-22^oС,
МИКРОАЭРОФИЛЬНЫЙ РОСТ
Штамм является строгим аэробом. Проверка жизнеспособности штамма осуществляется пересевом культуры на свежий сусло-агар с последующим выращиванием в термостате при 22^oС.

СПОСОБ ПЕРЕСЕВОВ
Продолжительность выращивания на косяках сусло-агара 7-8 суток, после чего штамм может храниться без пересевов 1-1.5 года.

СПОСОБ КОНСЕРВАЦИИ
Штамм может храниться на косяках сусло-агара при 4^oC в течение 1-1.5 лет без пересева. В Госколлекции микроорганизмов ИБФМАН России штамм хранится в жидком азоте 3 года без потери жизнеспособности.

НАЛИЧИЕ МАРКЕРНЫХ ПРИЗНАКОВ
Штамм продуцирует два вида эндотоксинов и обладает избирательным токсическим действием. Продуктивность Е. thaxteriana 19 по микоафидину Т составляет 0.85-0.9 г/л, по энтоксу 4.8-5.0 г/л среды соответственно, инсектицидная активность 98-100% в различных вариантах с тест-насекомыми. Уровень токсинообразования штамма является стабильным признаком: после 16 генераций токсигенность штамма и эффективность образцов препаратов остается на первоначальном уровне.

ПРИМЕР
Штаммы Е. thaxteriana 18 и 19 выращивают на среде, содержащей 1% соевой муки и 4% глюкозы, вода - остальное (рH 6.5-7.0) при 27^oС в течение 3 сут. Биомассу отфильтровывают, высушивают при 37^oС (до воздушно-сухого состояния) и размалывают.

Выделение микоафидииа Т из 1 г биомассы проводят этанолом в течение 60 мин, энтокса - гидролизуя биомассу спиртовым раствором щелочи. Полученные растворы отделяют фильтрованием от биомассы и выпаривают спирт до полного его удаления.

Выход микоафидина Т для штамма Е. thaxteriana 19 составляет 6.08%, энтокса 34.7% или 0.89 г/л и 4.9 г/л питательной среды соответственно.

Выход микоафидина Т для штамма E. thaxteriana 18 составляет 3.99%, энтокса - 11.5% или 0.25 и 0.98 г/л питательной среды соответственно.

Инсектицидную активность определяли экспресс-методом, описанным в "Методике испытаний микоафидина Т в лабораторных, полевых и производственных условиях" (составители: Воронина Э.Г., Мукамолова Т.Ю. и др., Ленинград - Пушкин, 1988). Метод состоит в следующем, в чашку Петри диаметром 40 мм на фильтр, смоченный 0.3 мл раствора препарата, помещали тлей, учет гибели проводили через 1 ч контакта с обработанной поверхностью, количество повторностей - 4-5 чашек, число насекомых в 1 чашке 20 - 30 особей.

Эффективность действия препаратов на личинок табачного трипса определяли экспресс-методом, аналогичным для тлей. Обработку паутинных клещей проводят путем окунания листьев фасоли с клещами в 1%-ную водную эмульсию препаратов. Листья затем помещают в чашки Петри с водой. Для предотвращения разбегания клещей гибель учитывают через 24 ч.

В табл. 1, 2 приведены инсектицидная активность и выход препаративных форм штаммов гриба Е. thaхteriana 18 и 19.

Таким образом, штамм Entomophthora thaxteriana 19 обладает повышенным уровнем токсинообразования и биологической эффективности, что позволяет снизить концентрацию рабочей эмульсии препаратов, полученных на его основе до 0.5% для достижения 90-100% гибели вредителей сельскохозяйственных культур в открытом и закрытом грунте.

Изобретение относится к области сельскохозяйственной микробиологии и может быть использовано при получении двух препаратов для защиты растений от тлей, паутинных клещей и трипсов. Изобретение состоит в получении нового штамма гриба, обладающего более высоким (по сравнению с известным) уровнем образования токсических веществ и инсектицидной активностью против сосущих вредителей. Штамм гриба Entomophthora thaxteriana 19 (ВИЗР) получен путем ступенчатого отбора из моноконидиального рассева природного изолята, выделенного из персиковой тли. Отбор проведен по признаку токсинообразования изолятов этого гриба при культивировании в глубинных условиях. Штамм гриба Entomophthora thaxteriana депонирован в коллекции чистых культур ВИЗР под 19. Выход микоафидина Т у штамма составляет 0,85-0,9г, энтокса 4,8-5,0 г с 1 л питательной среды, состоящей из 4% глюкозы, 1% соевой муки и воды, содержание микоафидина Т в биомассе 6,0-6,2%, энтокса 34,0-34,9%. Использование данного штамма позволяет снизить концентрацию рабочей эмульсии препаратов, полученных на его основе, до 0,5% с достижением 90-100% гибели вредителей сельскохозяйственных культур в открытом и закрытом грунтах. 2 табл.

Штамм гриба Entomophthora thaxteriana 19 (ВИЗР) для получения биопрепаратов микоафидин Т и энтокс против сосущих насекомых - вредителей и клещей.