ШТАММ ГРИБА ENTOMOPHTORA THAXTERIANA ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ПРОТИВ СОСУЩИХ НАСЕКОМЫХ И КЛЕЩЕЙ Советский патент 1996 года по МПК A01N63/04 C12N1/14 C12N1/14 C12R1/645 

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии, может быть использовано для получения биопрепаратов в борьбе с разными видами сосущих насекомых и клещей вредителей растений и представляет собой новый штамм энтомофторовых грибов.

Целью изобретения является получение нового штамма гриба Entomophthora thaxteriana, обладающего более высоким по сравнению с известными уровнем токсинообразования.

Штамм получен путем стабилизирующего отбора из моноспорового рассева природного изолятора, выделенного из персиковой тли. Отбор проведен по признаку токсинообразования изолятов этого гриба при культивировании в глубинных условиях.

Штамм депонирован в коллекции чистых культур ВНИИ защиты растений под номером 18.

Морфологические признаки. Вегетативный мицелий штамма насептированный бесцветный, распадающийся через 24-48 ч на короткие прямые или изогнутые гифенные тела. Образование конидиеносцев с конидиями происходит на субстратном мицелии.

Конидиеносцы короткие, бесцветные, неразветвленные, с одной конидией на конце.

Конидии сферические с сосочком у основания, содержат одно крупное или несколько мелких жировых включений.

Размеры конидий 25-39х21-32 мкм, в среднем 32х26 мкм. Конидии имеют однослойную клеточную стенку, гладкую поверхность.

Формирование покоящихся спор начинается на 2-3 сут. Покоящиеся споры округлые с двойной оболочкой и крупной жировой каплей в центре. Размеры покоящихся спор 20-25 мкм, в среднем 22 мкм. Поверхность спор гладкая, клеточная стенка трехслойная.

Культурально-морфологические признаки штамма изучены на сусле, средах Сабуро (1% пептона и 4% глюкозы) и соевой (1% соевой муки, 6% глюкозы). На всех указанных средах штамм образует плоские, гладкие и бесцветные колонии, которые при 48-часовом освещении покрываются налетом конидий, что придает колониям белый цвет. Пигмент в среду не выделяется.

Характер поверхностного роста гладкий. Скорость роста колонии в стандартных условиях (рН 6,5-8,0; температура выращивания 20-22^оС) на сусле и среде Сабуро 1 см в сутки, на соевой среде 0,7 см в сутки.

Цвет. На агаризованных питательных средах (сусло, пептон 1% с глюкозой 4% соевая мука 1% с глюкозой 6% соевая мука 1% с глюкозой 6%) штамм образует бесцветные колонии. Пигмент в среду не выделяется. Хорошо спорулирующая колония имеет белый цвет за счет обильного белого налета из конидий.

Физиологические признаки. Пигмент не образуется и в среду не выделяется. Из источников углерода хорошо усваивает глюкозу, мальтозу, фруктозу, крахмал, на которых отмечен наилучший рост и споруляция. На среде с аминокислотами может расти без углеводородов за счет углеродной части аминокислот, рост слабый, споруляция отсутствует. Плохо растет и спорулирует на сахарозе, лактозе, галактозе, арабинозе, ксилозе и спиртах.

Из источников азота усваивает смеси аминокислот, пептиды, белки, может расти на средах с аспарагином. Нитратный азот не усваивает, на средах с аммонийным рост слабый.

Температура. Рост отмечался в диапазоне температур 3-36^оС. Температурный оптимум для роста 20-28, для конидиеобразования 20-24^оС.

Микроаэрофильный рост. Штамм является строгим аэробом. Проверка жизнеспособности штамма осуществляется пересевом культуры (кусочком) на свежий сусло-агар с последующим выращиванием в термостате при 20-23^оС.

Способ пересевов. Продолжительность выращивания на косяках сусла-агара 7-8 сут, после чего штамм может храниться в холодильнике без пересевов 1-1,5 года.

Способ консервации. Штамм может храниться на косяках сусла-агара при 4^оС в течение 1-1,5 лет без пересева. В Госколлекции микроорганизмов ИБФМАН СССР штамм хранится в жидком азоте 3 года без потери жизнеспособности.

Наличие маркерных признаков. Штамм получен путем стабилизирующего отбора из природного изолятора Е.thaxteriana, выделенного из персиковой тли. Характерной особенностью штамма является высокий уровень токсинообразования, сохраняющийся при многократных пересевах.

Токсигенные свойства. Штамм продуцирует эндотоксин и обладает избирательным токсическим действием. Продуктивность Е.thaxteriana N 18 составляет 5078,5 ± 145 мкг токсина на 1 г сухой биомассы, инсектицидная активность 50-100% в разных вариантах с тест-насекомыми. Уровень токсинообразования штамма является стабильным признаком: после 15 генераций токсигенность штамма и эффективность образцов препарата остается на первоначальном уровне.

П р и м е р. Штаммы Е.thaxteriana 35-МР и 18 выращивают на среде, содержащей 1% соевой муки и 6% глюкозы, вода остальное (рН 6,5-7,0) при 28 ± 1,5^оС в течение 3 сут. Биомассу отфильтровывают и сушат при 37^оС до воздушно-сухой массы.

Экстракцию эндотоксина из 1 г биомассы проводят в 20 мл смеси хлороформ: этанол (1:1) в течение 10-15 мин. Наносят 0,3 мл отфильтрованного экстракта на пластинку "Силуфол". Для тонкослойной хроматографии используют систему толуол: метанол:хлороформ (7:2:1). Пятно токсина (Р=0,29 ± 0,02) проявляют в парах йода, слой сорбента снимают и переносят в пробирку для сжигания. В качестве контроля используют участок чистого слоя силикагеля, равного по площади пятну токсина. Затем в пробирки добавляют 0,55 мл 57%-ной хлорной кислоты и нагревают 30 мин на песчаной бане. После охлаждения в пробирки добавляют по 0,2 мл 5%-ного раствора амидола в 20% NaHSO₃ и 5%-ного раствора молибдата аммония, перемешивают, нагревают 7 мин на кипящей водяной бане, охлаждают и колориметрируют, измеряя оптическую плотность стойкого голубого раствора при 740 нм в кювете с толщиной оптического слоя 1 см на приборе КФК-2. Определение массы свободного фосфора в образце проводят по калибровочной прямой стандартного раствора КН₂РО₄, содержащего 2 мкг фосфора в 1 мл. Определение массы токсина проводят по формуле
Q где Q масса токсина в 0,1 мл раствора, мкг:
А_Р атомная масса фосфора 31;
р масса липидного фосфора, мкг.

Затем результаты пересчитывают с учетом объема полученного экстракта и влажности биомассы. Конечное значение соответствует содержанию токсина в 1 г сухой массы. Выход эндотоксина для штамма E.thaxteriana 35-MP составляет 1357,2 ± 112,5 мкг/г, для штамма E.thaxteriana N 18 5078,5 ± 145,9 мкг/г, с пересчетом на 1 мл питательной среды 198,2 и 797,3 мкг/мл соответственно. В табл.1 представлены сравнительные данные по токсинообразованию для штамма E. 18, культивированного на двух разных средах.

В лабораторных условиях инсектицидную активность определяют по смертности (тли, табачного трипса и паутинных клещей). Личинки старших возрастов и самок гороховой тли помещают в чашки Петри диаметром 30 мм на фильтр, смоченный 0,3 мл водной эмульсии эндотоксина заданной концентрации. Учет гибели насекомых проводят через 1 ч после обработки. Данные представлены в табл.2 и 3.

Личинки табачного трипса помещают в чашку Петри на фильтр, смоченный водной эмульсией препарата заданной концентрации. Гибель личинок учитывали через 1 ч. Обработку паутинных клещей проводят путем окунания листьев фасоли с клещами в водную эмульсию препарата заданной концентрации. Листья затем помещают в чашки Петри с водой для предотвращения разбегания клещей, гибель учитывают через 24 ч. Данные представлены в табл.4 и 5.

В условиях производственных теплиц препарат на основе штамма Entomophthora thaxteriana эффективен против персиковой и бахчевой тли, заселяющих перец и огурцы. Растения опрыскивают эмульсией препарата заданной концентрации (см. табл.6).

ЛК₅₀ для персиковой тли составляет 0,05-0,15 мг/мл, для бахчевой 0,04-0,05 мг/мл, для табачного трипса 0,14-0,15 мг/мл.

Таким образом, штамм Entomophthora thaxteriana 18 обладает повышенным уровнем токсинообразования, что позволяет снизить концентрацию рабочей эмульсии препарата, полученного на его основе, до 0,25-0,5% для достижения 80-90% -ной гибели вредителей сельскохозяйственных культур в открытом и закрытом грунте.

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии, может быть использовано для получения биопрепаратов в борьбе с разными видами сосущих насекомых и клещей - вредителей растений - и представляет собой новый штамм энтомофторовых грибов. Целью изобретения является получение нового штамма гриба Entomophthora thaxteriana, обладающего более высоким по сравнению с известными уровнем токсикообразования. Штамм получен путем стабилизирующего отбора из моноспорового рассева природного изолятора, выделенного из персиковой тли. Отбор проведен по признаку токсикообразования изолятов этого гриба при культивировании в глубинных условиях. Штамм депонирован в коллекции чистых культур ВНИИ защиты растений под N 18. Выход эндотоксина у штамма составляет 5078,5 ± 145,9 мкг/г биомассы или с пересчетом на 1 мл питательной среды 797,3 мкг/мл на среде, содержащей соевую муку (1%), глюкозу (6%), воду (остальное). У известного штамма 35-МР выход эндотоксина составляет 1357,2 ± 112,5 мкг/г и 198,2 мкг/мл соответственно. 6 табл.

Штамм гриба Entomophtora thaxteriana ВИЗР N 18 для получения препарата против сосущих насекомых и клещей.