ШТАММ ГРИБА ENTOMOPHTHORA THAXTERIANA (PETCH.) (ZYGOMYCETES; ENTOMOPHTHORALES) № 9 (ВИЗР) - ПРОДУЦЕНТ БИОПРЕПАРАТА ЭНТОКС Российский патент 2004 года по МПК C12N1/14 A01N63/04 C12N1/14 C12R1/645 

Предложение относится к области сельскохозяйственной микробиологии и может быть использовано при получении препаратов для защиты растений от глей, паутинных клещей и трипсов.

Известны штаммы гриба Entomophthora thaxteriana Fetch. № 18, 35-МР и 19-11 (Zygomycetes; Entomophthorales) (ВИЗР) (А.С. № 1345385 и № 2150836), являющиеся продуцентами токсических веществ - основы биопрепаратов. Однако в процессе сохранения и многократных пересевов штамм № 35-МР утратил свои токсинообразующие свойства, и снизил биологическую эффективность по отношению к насекомым - вредителям. Штамм 19-11 был отобран как продуцент микоафидина Т и в связи с этим имеет очень низкую продуктивность по энтоксу.

За прототип взят штамм № 18 (А.С. № 1658432), так же являющийся продуцентом токсинов, со временем его токсинообразующие свойства и активность токсинов значительно понизились.

Задача изобретения состоит в получении нового штамма гриба, обладающего более высоким (по сравнению с известным) уровнем образования токсических веществ (основы биопрепарата энтокс) и инсектицидной активностью, против сосущих вредителей. Штамм Entomophthora thaxteriana (Petch.) № 9 (ВИЗР) получен путем ступенчатого отбора из моноконидиального рассева природного изолята, выделенного из персиковой тли. Отбор проведен по признаку образования токсинов - энтокса изолятами этого гриба при культивировании в глубинных условиях. Штамм Entomophthora thaxteriana (Petch.) депонирован в коллекции чистых культур ВИЗР под № 9. Выход энтокса - у штамма 8.39-8.45 г с 1 л питательной среды, состоящей из 4% глюкозы, 1% соевой муки и воды (остальное). Содержание энтокса в биомассе 70-71%.

Mорфологические признаки

Вегетативный мицелий штамма несентированный бесцветный, распадающийся через 24 ч на короткие прямые или изогнутые гифенные тела. Образование конидиеносцев с конидиями происходит на субстратном мицелии.

Конидиеносцы короткие, бесцветные, неразветвленные, с одной конидией на конце.

Конидии сферические с сосочком у основания содержат одно крупное или несколько мелких жировых включений.

Гомеры конидий 25-39×21-32 мкм, в среднем 32×26 мкм. Конидии имеют однослойную клеточную стенку, гладкую поверхность.

Формирование покоящихся спор начинается к 66 часам роста. Покоящиеся споры округлые с двойной оболочкой и крупной жировой каплей в центре. Размеры покоящихся спор 20-25 мкм, в среднем 22 мкм. Поверхность спор гладкая, клеточная стенка трехслойная.

Культурально-морфологические признаки штамма изучены на сусло (50% не охмеленное пивное сусло), среде Сабуро (1% пептон и 4% глюкозы) и соевой (1% соевой муки и 4% глюкозы). На всех указанных средах штамм образует плоские, гладкие и бесцветные колонии, которые при 24 часовом освещении покрываются налетом конидий, что придает колониям белый цвет. Пигмент в среду не выделяется.

Характер поверхностного роста гладкий. Скорость роста колонии в стандартных условиях (рН 6,5-7,0; температура выращивания 22°С) на сусло и среде Сабуро 3.0 мм сутки, на соевой среде - 2,8 мм сутки.

Цвет

На агаризированных питательных средах (Сабуро, соевой и сусло) штамм образует бесцветные колонии. Пигмент в среду не выделяется. Хорошо спорулирующая колония имеет белый цвет за счет обильного белого налета из конидий.

Физиологические признаки

Пигмент не образуется и в среду не выделяется. Из источников углерода хорошо усваивает глюкозу, мальтозу, крахмал, фруктозу (на них отмечен наилучший рост и споруляция). На среде с аминокислотами может расти без углеводородов за счет углеродной части аминокислот, однако, рост слабый и сноруляция отсутствует. Плохо растет и спорулирует на средах, содержащих сахарозу, лактозу, галактозу, арабинозу, ксилозу и спирты.

Из источников азота усваивает смеси аминокислот, пептиды, белки, может расти на средах с аспарагином. Нитратный азот не усваивает, на средах с аммонийным азотом - рост слабый.

Температура

Рост отмечался в диапазоне температур +3-36°С. Температурный оптимум для роста 27°С для конидиеобразования 20-22°С.

Микроаэрофильный рост.

Штамм является строгим аэробом. Проверка жизнеспособности штамма осуществляется пересевом культуры на свежеприготовленный сусло-агар с последующим выращиванием в термостате при 22°С.

Способ пересевов

Продолжительность выращивания на косяках сусло-агара 7-8 суток, после чего штамм может храниться без пересевов 1-1,5 года.

Способ консервации

Штамм может храниться на косяках cуcлo-aгapa при +4°С в течение 1-1.5 лет без пересева. В Госколлекции микроорганизмов ВИЗР России штамм хранится 8 лет без потери жизнеспособности.

Наличие маркерных признаков

Штамм продуцирует два вида эндотоксинов (микоафидин Т в меньшем количестве и энтокс в большем) и обладает избирательным токсическим действием. Продуктивность Entomophthora thaxteriana (Petch.) № 9 но энтоксу - 8,39-8,48 г/л среды, инсектицидная активность 98-100% в различных вариантах с тест - насекомыми. Уровень токсинообразования штамма является стабильным признаком: после 16 генераций токсигенность штамма и эффективность образцов препаратов остается на первоначальном уровне.

Пример

Штаммы Е. thaxteriana № 35-МР, 18, 19-11 и № 9 выращивают на среде содержащей 1% соевой муки и 4% глюкозы, вода - остальное (рН 6,5-7,0) при 27°С в течение 3 суток. Биомассу отфильтровывают, высушивают при температуре 37°С (до воздушно-сухого состояния) и размалывают.

Выделение энтокса из 1 г биомассы проводят, гидролизуя ее спиртовым раствором щелочи. Полученные растворы отделяют фильтрованием от биомассы и выпаривают спирт до полного его удаления.

Выход энтокса для штамма Е. thaxteriana № 9 составляет 71% или 8,482 г/л питательной среды соответственно.

Выход энтокса для штамма Е. thaxteriana № 35-МР составляет 45% или 3,5 г/л питательной среды соответственно.

Выход энтокса для штамма Е. thaxteriana № 18 составляет 11,5% или 0,35 г/л питательной среды соответственно.

Выход энтокса для штамма Е. thaxteriana № 19-11 составляет 14,5% или 1,885 г/л питательной среды соответственно.

Инсектицидную активность определяли экспресс-методом, описанным в "Методике испытаний микоафидина Т в лабораторных, полевых и производственных условиях" (составители: Воронина Э.Г., Мукамолова Т.Ю. и др. Л. - Пушкин, 1988). Метод состоит в следующем: в чашку Петри диаметром 40 мм на фильтр, смоченный 0,3 мл раствора препарата, помещали тлей, учет гибели проводили через 1 ч контакта с обработанной поверхностью, количество повторностей - 4-5 чашек, число насекомых в 1 чашке 20-30 особей.

Эффективность действия препаратов на личинок табачного трипса определяли экспресс-методом, аналогичным для тлей. Обработку паутинных клещей проводят путем окунания листьев фасоли с клещами в 1% водную эмульсию препаратов. Листья затем помещают в чашки Петри с водой для предотвращения перемещения клещей с обработанной поверхности, гибель учитывают через 24 ч.

В табл. 1, 2 приведены инсектицидная активность и выход препаративных форм штаммов гриба Е. thaxteriana № 18 и № 9.

Таким образом, штамм Entomophthora thaxteriana (Рetch.) № 9 обладает повышенным уровнем токсинообразования и биологической эффективности, что позволяет снизить концентрацию рабочей эмульсии препаратов, полученных на его основе до 0,5% для достижения 90-100% гибели вредителей сельскохозяйственных культур в открытом и закрытом грунте.

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и может быть использовано при получении препаратов для защиты растений от тлей, паутинных клещей и трипсов. Штамм Entomophthora thaxteriana (Petch.) № 9 (ВИЗР) получен путем ступенчатого отбора из моноконидиального рассева природного изолята, выделенного из персиковой тли. Отбор проведен по признаку образования токсинов энтокса изолятами этого гриба при культивировании в глубинных условиях. Штамм Entomophthora thaxteriana (Petch.) депонирован в коллекции чистых культур ВИЗР под № 9. Выход энтокса у штамма составляет - 8,39-8,45 г с 1 л питательной среды, состоящей из 4% глюкозы, 1% соевой муки и воды. Содержание энтокса в биомассе 70-71%. Полученный штамм гриба обладает более высоким (по сравнению с известным) уровнем образования токсических веществ (основы биопрепарата энтокс) и инсектицидной активностью против сосущих вредителей. 2 табл.

Штамм гриба Entomophthora thaxteriana (Petch.) (Zygomycetes; Entomophthorales) № 9 (ВИЗР) для получения биопрепарата энтокс против сосущих насекомых-вредителей и клещей.