СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОЙ ХОЛИНЭСТЕРАЗЫ Российский патент 1994 года по МПК C12N11/14 G01N27/30 

Изобретение относится к биотехнологии, биохимии и инженерной энзимологии и может быть использовано в лабораториях и предприятиях аналитического, биохимического и медицинского профилей для применения в различных типах аналитических систем, для изготовления на их основе высокочувствительных анализаторов для определения биологически активных веществ, в том числе обладающих антихолинэстеразным действием. Данное изобретение предназначено для получения высокоактивных препаратов иммобилизованной холинэстеразы (ИХЭ), которые могут найти применение в устройствах для контроля степени загрязнения воздуха, водоемов и рек ингибиторами холинэстераз, производными карбаминовой кислоты, фосфорорганическими соединениями, широко применяемыми в сельском хозяйстве в качестве пестицидов.

Известны различные способы иммобилизации ферментов. Для этих целей используют как физические так и химические способы переведения ферментов в нерастворимое соединение. Например, холинэстеразу иммобилизуют путем адсорбции на различных твердых носителях: силикагелях, стекле, графитовых материалах. Известны также способы включения ХЭ в различные гели: крахмальный, полиакриламидный, а также пленки.

К недостаткам этих способов относятся непрочность связей между носителем и ферментом, набухание гелей и пленок, возможность отщепления фермента от матрицы, что приводит к изменению каталитической активности иммобилизованных образцов. Срок хранения таких препаратов колеблется от нескольких дней до нескольких месяцев. Химические методы иммобилизации предлагают обработку или носителей или фермента соединениями, переводящими их в химически активную форму, которую используют для получения более устойчивых стабильных образцов иммобилизованных препаратов.

К недостаткам таких способов относятся сложность и многостадийность операций при подготовке носителя, частичная потеря каталитической активности ферментов и относительно небольшой срок хранения.

Наиболее близким к описываемому техническому решению по сущности и достигаемому результату является способ иммобилизации холинэстеразы (ХЭ), заключающийся в комбинированном одновременном действии глутарового альдегида (ГА) и включения в пленку из нитрата целлюлозы.

Недостатками этого способа являются непосредственный контакт ХЭ с ГА - бифункциональным реагентом, что приводит к уменьшению каталитической активности фермента вследствие возможного взаимодействия реагента с группировками, входящими в активный центр ХЭ и, как следствие, к получению образцов ИХЭ с небольшой активностью, а также небольшой срок хранения ИХЭ (две недели) без изменения каталитической активности.

Целью изобретения являются повышение активности образцов ИХЭ, обеспечение стабильности каталитических свойств ХЭ в процесс получения образцов иммобилизованного фермента и их устойчивости при длительном хранении, улучшение их эксплуатационных характеристик, заключающихся в повышенной чувствительности к ингибиторам холинэстераз, т. е. расширении диапазона определяемых концентраций и снижении нижней границы определяемых содержаний антихолинэстеразных соединений.

Цель достигается путем первоначального включения ХЭ в пленки из нитрата целлюлозы и затем последующей обработкой готовых пленок раствором ГА.

Способ осуществляется следующим образом.

В качестве носителя используют нитрат целлюлозы (НЦ) со средним содержанием азота (11,5-12,0% ). НЦ при перемешивании растворяют в смеси органических растворителей толуола и бутилацетата. Добавляют раствор ХЭ и гексан в качестве коагулянта, раствор снова перемешивают. Эту смесь выливают тонким слоем на гладкую поверхность (стекло, фторопласт, целлофан и др. ), высушивают в потоке воздуха при температуре не выше 30^оС. Высушенную пленку обрабатывают водным раствором А для более прочного связывания фермента с матрицей. Затем промывают водой до полного исчезновения запаха глутарового альдегида.

Полученная пленка обладает высокой механической прочностью, не набухает в водных растворах и не растворяется в них, содержит фермент, равномерно распределенный по всему ее объему. Мягкие условия эксперимента позволяют получить пленку, обладающую высокой ферментативной активностью (А = 0,053 + 0,003 мкмоль/мин. см²), причем каталитическая активность сохраняется в течение длительного времени (один год). Все это позволяет использовать ферментосодержащую пленку в качестве составной части высокочувствительных анализаторов для определения биологически активных веществ, в частности - биохимического сенсора (ферментного электрода) для определения ингибиторов ХЭ.

П р и м е р 1. Навеску НЦ 0,05 г растворяют при комнатной температуре и постоянном перемешивании в смеси 1 мл толуола и 1,6 мл бутилацетата до полного растворения. Навеску ХЭ 0,018 г (активность 110 АЕ/мг) растворяют в 0,2 мл бидистиллированной воды. Этот раствор добавляют к раствору НЦ и перемешивают в течение 3 мин. Сюда же добавляют три капли гексана и снова перемешивают в течение 2 мин. Смесь выливают тонким слоем на ровную стеклянную поверхность (чашки Петри диаметром 9,5 см) и высушивают в потоке воздуха при комнатной температуре. Сухую ферментосодержащую пленку погружают в 5% -ный водный раствор ГА на 3 мин. Затем ее промывают дистиллированной водой до полного исчезновения запаха ГА. Отмытую от глутарового альдегида ферментсодержащую мембрану сушат в потоке воздуха.

Определение активности ИХЭ основано на измерении высоты катодного пика при потенциале - 0,55 В, наблюдающегося на вольтамперограммах боратного буферного раствора субстрата ХЭ - бутирилтиохолин иодида (БТХИ) в присутствии биохимического сенсора, состоящего из стационарного ртутно-пленочного электрода с серебряной подложкой и иммобилизованной предлагаемым способом холинэстеразой (используют кусок пленки определенного размера 2,5х6,5 см).

Катодный ток при потенциале -0,55 В (относительно нас. к. э. ) измеряют с помощью осциллографического полярографа ПО-5122, модель 03 в боратном буферном растворе с рН = 9,0 ± 0,1 при температуре 25 ± 0,1^оС. Концентрация субстрата ХЭ БТХИ 2,0.10^-3 моль/л.

П р и м е р 2. В полярографическую ячейку, содержащую 4,5 мл боратного буферного раствора и 0,5 мл 2,0.10^-2 моль/л БТХИ, помещают биохимический сенсор, включающий ИХЭ, полученную предлагаемым способом. Раствор продувают током аргона в течение 15 мин (время ферментативной реакции должно быть постоянным и снимают вольтамперограмму в интервале потенциалов -0,10 + -0,80 В. (V = 1 B/c, треугольная развертка потенциала). Измеряют величину тока (высоту пика) при потенциале -0,55 В.

Активность иммобилизованного фермента рассчитывают по формуле
A= (i_п-i°п

)·α·10⁶·V/t·S·1000 , где А - удельная активность ферментсодержащей пленки, Е/см²;
i_n - ток в пике (мкА) в присутствии ИХЭ;
i_n^o - ток в пике при спонтанном гидролизе субстрата в отсутствие ИХЭ),
α - переходный коэффициент, моль/л. мкА;
V - общий объем раствора в ячейке, мл;
t - время ферментативной реакции, мин;
S - площадь ферментсодержащей пленки, используемой в биосенсоре, см².

Результаты определения активности ИХЭ приведены в табл. 1.

Биосенсорная часть ферментного электрода, полученная предлагаемым способом, обладает не только более высокой каталитической активностью, но и более высокой чувствительностью к ингибиторам ХЭ, в частности к пестицидам.

Определение ингибиторов осуществляется следующим образом.

П р и м е р 3. В полярографическую ячейку, содержащую 4,0-4,4 мл боратного буферного раствора, 0,5 мл 2,0 ˙ 10^-2 моль/л БТХИ и 0,1 - 0,5 мл раствора с соответствующей концентрацией ингибитора ХЭ, помещают биохимический сенсор, включающий ИХЭ, полученную предлагаемым способом. Раствор продувают током аргона в течение 15 мин и снимают вольтамперограмму в интервале потенциалов -0,10 - -0,80 В. Измеряют ток при потенциале -0,55 В (в присутствии ингибитора величина тока в пике меньше по сравнению с контрольным опытом). Строят градуировочный график зависимости величины тока в пике (i_n) от -lgC_инг. По градуировочному графику определяют неизвестное количество ингибитора в анализируемом растворе.

Результаты приведены в табл. 2 и 3.

Как следует из приведенных в табл. 3 результатов, предлагаемый способ иммобилизации ХЭ позволяет получить биосенсорную часть ферментного электрода, обеспечивающую более широкий интервал определяемых концентраций ингибиторов (от n 10^-2 до n 10^-14 моль/л в отличие от известного n 10^-3 до n 10^-11 моль/л), а также более низкие границы определяемых содержаний (до 9,5 10^-14 моль/л). Кроме того, биосенсорная часть сохраняет свою каталитическую активность практически без изменения при хранении при 4^оС в течение более длительного времени (не менее одного года).

Таким образом, описываемый способ иммобилизации позволяет увеличить удельную активность ИХЭ, обеспечить стабильность каталитических свойств фермента в течение не менее года, улучшить ее эксплуатационные характеристики, что выражается в более широком диапазоне определяемых содержаний ингибиторов ХЭ и более низкой нижней (на 2-3 порядка) границе определяемых содержаний. Предлагаемый способ получения образцов ИХЭ, используемых в качестве биосенсорной части ферментных электродов, является оптимальным, что подтверждается результатами, приведенными в табл. 4 и 5. (56) Иммобилизованные ферменты: Современное состояние и перспективы. М. : Изд-во МГУ, 1976, т. 1,2, 296, 358 с.

Будников Г. К. , Медянцева Э. П. , Волков А. В. , Аронзон С. С. Журнал аналитической химии, 1983, т. 38, N 7, с. 1283.

Братов А. В. , Власов Ю. Г. , Кузнецова Л. П. , Левичев С. С. , Никольская Е. Б. , Тарантов Ю. А. Химические сенсоры-89: Тезисы докл. Всесоюзн. конф. Ленинград, 1989, с. 235.

Кузнецова Л. П. , Ягодина О. В. , Кугушева Л. И. , Никольская Е. Б. Химические сенсоры-89: Тезисы Всесоюзн. конф. Лениград, 1989, с. 214.

Авторское свидетельство СССР N 1409656, кл. С 12 N 11/13, 1986.

Авторское свидетельство СССР N 1472503, кл. С 12 N 11/00, 1987.

Guhathakurta S. , Bhattacharya Shelley. Ind. I. Exp. Biol. 1988. v. 26, N 1, p. 44.

Авторское свидетельство СССР N 1296913, кл. G 01 N 27/30, 1986.

Использование: биотехнология, биохимия и инженерная энзимология и может быть использовано для решения аналитических, медицинских и экологических проблем, связанных с определением ингибиторов холинэстераз. Сущность изобретения: получают пленку из нитрата целлюлозы с включенной в нее холинэстеразой с последующей обработкой пленки раствором глутарового альдегида. 2 з. п. ф-лы.

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОЙ ХОЛИНЭСТЕРАЗЫ, заключающийся во введении ее в пленкообразную смесь, приготовленную на основе нитрата целлюлозы, растворенного в смеси толуола и бутилацетата, добавлении гексана, формировании тонкого слоя пленки и высушивании ее, отличающийся тем, что, с целью увеличения активности, обеспечения стабильности каталитических свойств холинэстеразы в процессе ее получения и хранения, высушенную пленку обрабатывают водным раствором глутарового альдегида. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что концентрацию глутарового альдегида устанавливают от 4,5 до 5,5 мас. % . 3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что при приготовлении пленкообразующей смеси концентрацию холинэстеразы устанавливают от 25,4 до 27,5 мас. % .