Ферментный электрод для определения концентрации тиохолиновых эфиров Советский патент 1987 года по МПК G01N27/30 

+

Изобретение относится к электрохимическим устройствам, используемым в аналитической химии для определения соответствующих субстратов, ингибиторов, активаторов холинэс- тераз, а также может быть использовно в энзимологии для определения скростей ферментативных реакций.

Цель изобретения - увеличение чувствительности и селективности определений .

Отклик ферментного электрода на концентрацию субстратов холинэсте- раз наблюдается практически мгновенно.

Определение субстратов и ингибиторов ХЭ основано на электрохимической активности одного из продуктов гидролиза субстрата, специфичного к ХЭ - бутирилтиохолин иодида (БТХИ

CjH COSCH - NiCH,), J + N(CH,),j.J.,

Продукт гидролиза БТХИ - тиол спсобен образовывать меркаптид ртути, который восстанавливается на ртутно капельном и амальгамированном серебряном электродах.

На вольтамперограммах БТХИ на стационарном амальгамированном сере ряном электроде наблюдается небольшой, пик при потенциале -0,55 В относительно насыщенного каломельного электрода, который быстро растет в присутствии ХЭ. Высота пика зависит от концентрации как субстрата и ингибиторов ХЭ, так и ее активности и концентрации. Ферментный электрод и электрод сравнения погружают в анализируемый раствор, содержащий буферный боратный раствор с рН 8,2- 8,4. Раствор термостатируют при 25 или 37°С, продувают током водорода или аргона и снимают вольтамперо- граммы в интервале потенциалов (-0,1)-(-0,8) В. Минимальный объем анализируемого раствора 4-5 мл.

На чертеже изображен предлагаемый электрод.

Электрод состоит из стеклянного или фторопластового корпуса амальгамированного серебряного электрода

1, в который вставлена серебряная проволока 2, спаянная с медной 3,, гофрированной пленки 4 из нитрата целлюлозы с включенной в нее ХЭ и прижимных колец 5.

Серебряную проволоку диаметром 0,5 мм закрепляют в стеклянной труб

«i

0

5

0

ке или фторопластовом стержне с помощью эпоксидной смолы ЭПД или механически. Затем поверхность электрода шлифуют до зеркального блеска и опускают в металлическую ртуть на 2 мин и излишки ртути стряхивают. Для получения иммобилизованной ХЭ 0,1 г нитрата целлюлозы растворяют в смеси органических растворителей толуола и бутилацетата (1:1,6), добавляют 0,2 мп водного раствора ХЭ (навеска 0,0180 г) и после перемешивания - гексан в качестве коагулянта. Для более прочного связывания фермента с матрицей перед добавлением гексана приливают 0,1 мл 25%-ного раствору глутарового альдегида. Из этой смеси на стеклянной поверхности получают пленку, из которой вырезают кусочки размером 25-65 мм. Пленку закрепляют на поверхности корпуса электрода с помощью прижимных колец или других зажимов, для увеличения рабочей поверхности пленку используют в гофрированном виде.

Определения с предлагаемым ферментным электродом осуществляют следующим образом.

Пример 1, Построение градуя- ровочного графика для определе 1ия БТХИ.

В мерную колбу на 5 мл вводят 0,05-3,00 мл стандартного раствора БТХИ с концентрацией 0,005 г/кл 5 доводят до метки боратным буферным раствором с рН 8jA. Переносят раствор в электролитическую ячейку с насыщенным каломельным электродом и ферментным электродом, удаляют кислород продуванием в течение 15 мин (время достижения равновесия реакции гидролиза должно быть постоянным во всех определениях) аргоном или электролитически генерированным водородом. Снимают вольтамперограм- мы в интервале потенциалов от -0,1 до 0,8 В при скорости наложения потенциала 1 В/с при непрерывном режиме поляризации с треугольной разверткой потенциала. Измеряют ту пика при потенциале -0,55 В. .. Строят градуировочную прямую, выражающую зависимость величины тока в пике от концентрации БТХИ.

O

5

0

Определение неизвестной концентрации субстрата.

В мерную колбу на 5 мл вносят н( известное количество БТХИ, доводят

31296913

до метки боратяым буфером с рН 8,4, перемешивают и переносят ячейку. Все дальнейшие операции проводят как описано выше. По высоте пика при потенциале -0,55 В и градуировоч- s ному графику определяют концентрацию субстрата,

В табл, 1 приведены результаты определения БТХИ с помощью предлагаемого ферментного электрода ( 10

Р 0,95).

Таблица 1

П р и м е р 2. Определение концентрации ингибитора (хлорофоса). В медную колбу на 5 мл вводят 1 мл стандартного раствора БТХИ концентрацией 0,005 г/мл, добавляют от 0,05 до 0,20 мл стандартного расвора хлорофоса с концентрацией 0,005 г/мл, доводят боратным буферным раствором до метки, перемешиваю и переносят в электролитическую ячейку с насыщенным каломельным и ферментным электродами. Удаляют кислород в течение 15 мин током аргона или водорода и снимают вольтам- перограммы в интервале потенциалов (-0,1)-(-0,8) Б (скорость наложения потенциала 1 Б/с, непрерывный режим поляризации, треугольная развертка потенциала), Измеряют высоту катодного пика при потенциале -0,55 Б. Строят градуировочную прямую, выражающую зависимость высоты катодного пика dT концентрации ингибитора.

. Неизвестную концентрацию ингибитора находят по градуировочному графику,

В табл, 2 приведены некоторые результаты определения хлорофоса с помощью предлагаемого ферментного электрода (п 4; Р 0,95).

Таблица 2

Предлагаемый ферментный электрод позволяет снизить нижнюю границу определяемых содержаний субстрата по сравнению с известными способами определений до 110 моль/л, повысить селективность определений (дает отклик в присутствии лишь тиохолиновых зфиров), С помощью предлагаемого электрода можно определять не только субстраты, но и ингибиторы холинэстераз до концентрации (0,2-10 г/мл). Электрод прост в изготовлении, его конструк7 ция позволяет легко заменить фермент, потерявший активность на новый, путем замены пленки, содержащей иммобилизованную ХЭ.

Время жизни мембраны составляет 1 неделю.

Формула изобретения

Ферментный электрод для определения концентрации тиохолиновых эфиров, включающий , внутри которого расположен токосъемник, электролитически связанный с мембраной, отличающийся тем,-что, с целью повышения чувствительности и селективности определения, в качестве токосъемника использован серебряный амальгамированный электрод, а мембрана выполнена из пленки на основе нитрата целлюлозы с введенными в нее холинэстеразой и глутаровым альдегидом в следующих количествах, мае, %:

Холинэстераза Глутаровый альдегидНитрат целлюлозы

5

Изобретение относится к аналитической химии и может быть использв- вано для определения субстратов холинэстераз. С целью повышения чувствительности и селективности определения токосъемник выполняют из амальгамированного серебра. Мембрана выполнена из нитрата целлюлозы, в которую введена холинэстераза и - глутаровый альдегид в количестве 10,6-12,6 и 17,5-18,0 мас. соответственно. Это позволяет определять субстрат в количестве I 10 м/л в присутствии тиохолиновых зфиров. 1 ил.,2 табл. а (Л :о о со

Составитель И. Роггшь Редактор Н. Киштулинец Техред и,Попович Корректор Г. Решетник

Заказ 769/45Тираж 777Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР.

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб.,д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4