Ферментный электрод для иммуноферментного анализа Советский патент 1992 года по МПК G01N27/333 

Изобретение относится к области биохимии и иммунологии, может найти применение в ветеринарии и медицине для диагностики различных заболеваний.

Целью изобретения является расширение аналитических возможностей электрода.

На чертеже пр едставлен график за- исимости высоты катодного пика от - концентрации антител.

Образцы полученной мембраны размерами мм помещают на 30 мин при комнатной температуре в 1%-ный раствор бычьего сывороточного альбумина в физиологическом фосфатном (0,01 М) буферном растворе (ФФБ) с рН 7,0-7,1 для блокирования активных центров глутарового альдегида и

предотвращения неспецифического связывания антител (AT). После промывки боратным буферным раствором с рН пленку закрепляют в гофрированном виде на поверхности корпуса стационарного ртутно-пленочного электрода с серебряной подложкой с помощью прижимных колец.

Определение специфических AT основано на электрохимической активности одного из продуктов гидролиза субстрата, специфичного к ХЭ-бутирил- тиохолиниодида (ВТХИ) C,H7COSCH2 уо

(CH),J + - С,НГСОСН + HSCH2 -CH2-(CH3)3J.

v

vl

ajl

Ю Ю

Продукт гидролиза БТХИ тиол способен образовывать меркаптид ртути,

10

15

оторый восстанавливается на ртутом и амальгамированном серебряном лектродах.

На вольтамперограммах БТ.ХИ на тационарном ртутно-пленочном электроде с серебряной подложкой наблюдается небольшой пик при потенциале - 0,55 В относительно насыщенного кало- мельного электрода, который быстро растет в присутствии ХЭ. Высота этого пика зависит как от концентрации субстрата так и от активности ХЭ. При наличии в исследуемом растворе специфических AT происходит быстрое, благодаря перемешиванию, связывание этих AT с иммобилизоваиными в нитро- целлюлозной пленке антигенами (АГ) с образованием иммунного комплекса АГАТ. Иммобилизованные таким образом ч . иммунокомплексы создают стерические препятствия для подхода молекул субстрата и активным центрам иммобилизованной ХЭ, что приводит к спаду-вы соты пика при потенциале - 0,55 В. Ферментный электрод и электрод сравнения погружают в анализируемый раствор, содержащий буферный боратный раствор с рН 9,05. Раствор термостати - руют при 25° С или 37°С, продувают током водорода или аргона и снимают вольтамперогранмы в интервале потенциалов -0,1 - -0,8 В. Минимальный объем анализируемого раствора -5 млг . Титр определяемых AT с использованием предлагаемых ферментных электродов составляет 1:1001)0.

Предлагаемый ферментный эле(трод был использован для диагностики алеутской болезни норок.

П р и м е р.1. Построение градуи- ровочного графика для определения концентрации AT в сыворотке крови больных животных.

В мерную колбу на 5 мл вводят 0,5 мл стандартного раствора БТХИ с концентрацией 0,006 г/мл, добавляют от 1 до 100 мкл гаммаглобулиноаой фракции, из сыворотки крови больных норок с концентрацией белка 0,8 мг/мл. Раствор доводят боратный буфером с рН 9,05 до метки, перемешивают и переносят в электролитическую ячейку с насыщенным каломельным электродом и ферментгым электродом, содержащим в пленке из нитрата целлюлозы им- мобилизомннь й ЛГ (коммерческий препарат зверосовхозе. Пушкинский) . Удаляют кислород в течение 15 мин

2

2

0

5

0

5

0

35

40

45

50

55

током водорода или аргона и снимают вольтамперограммы а интервале потенциалов от -0,1 до -0,8 В (скорость наложения потенциала 1 В/с). Измеряют высоту катодного пика при потенциале 0,55 В. Строя градуировочный график, рыражающий зависимость высоты катодного пика от концентрации AT.

Далее определяют неизвестную концентрацию специфических антител.

В мерную колбу на 5 мл вводят 0,5 мл стандартного раствора БТХИ с концентрацией 0,006 г/мл, добавляют 3 мкл сыворотки исследуемых животных, доводят до метки боратным буфером с рН 9,05, перемешивают и переносят в ячейку. Все дальнейшие операции проводят, как описано выше. По высоте пика при потенциале -0,55В и градуировочному графику определяют концентрацию специфических антител:

Диагностику проводят по разнице величин пиков при потенциале -0,55 В в отсутствие и в присутствии анализируемой сыворотки животных. Эта разни- ™ца в величинах сигналов составляет не менее 2-3 величин стандартного отклонения величины пиков при потенциале -U,55 В в присутствии сыворотки здоровых ивотных (нулевого стан- дартг). Стандартное отклонение составляет в наших условиях 0, м.

Чувствительность предлагаемого метода составляет 5,3 НГ(0моль/л спе- . цифических антител. Ошибка определения составляет k%, отклик электрода наступает практически мгновенно.

Для многократного использования предлагаемых ферментных электродов и возможности автоматизации процесса диагностики заболеваний разрабо- . таны условия реактивации пленок из НЦ с иммобилизованной ХЭ, заингиби- рованной при образовании на поверхности пленок иммунных комплексов. При выдерживании сенсорной части ферментных электродов после измерения исследуемых образцов в С,6 М раст- воре хлорида магния в течение 15 мин пик при -0,55 В достигает исходной величины, что указывает на реактивацию вследствие разрушения комплекса АГ-АТ.

Все результаты определений контролировались методом иммунофермент- ного анализа со спектрофотометричес- кой индикацией ферментной активности.

Предлагаемые ферментные электроды позволяют селективно (селективность устанавливаю- по отсутствию спада пика при потенциале -0,55 В в при- сутствии вместо AT норки гаммаглобу- линов человека) и с-достаточной чувствительностью (5,3 Ю °моль/л) проводить диагностику различных заболеваний животных и человека.10

Реактивация сенсор.ной части элект- родов позволяет использовать их многократно, а также для экспресс-диагностики. Время жизни пленки составляет 30 дней.15

Формула

зобретения

ферментный электрод для иммунофер- ментного анализа, включающий корпус, 20

внутри-которого расположен токосъемник, электролитически связанный с мембраной, содержащей антитела, отличающийся тем, что, с целью расширения аналитических возможностей электрода, мембрана выполнена из пленки на основе нитрата целлюлозы с введенными в нее холинэсте разой, глутаровым альдегидом и антигеном (или антителами) в следующих количествах, мас.%:

Холинэстераза Антиген (или антитела)

Глутаровый альдегид Нитрат целлюлозы

10,6-12,6

0,33-0,66 (0,145-0,55)

f

17,5-18,0 Остальное

Изобретение относится к биохимии и иммунологии, и может найти применение в ветеринарии и медицине для диагностики различных заболеваний. Целью изобретения является обеспечение возможности определения содержания антител или антигена в анализируемых образцах для диагностики различных заболеваний, в частности алеутской болезни норок. Поставленная цель достигается тем, что в мембрану известного ферментного эле/трог дополнительно сведен антиген или антитела в количестве 0,33- 0,66. мае.%, Чувствительность определений содержания составляет 5,3х х11Гсмоль/л, время определения 15 мин время жизни мембраны 31 су т. 1 ил. а &

1р.нкЛ

10

:

15

А/