Способ получения сорбента для иммобилизации липолитических ферментов Советский патент 1989 года по МПК B01D15/08 

Изобретение относится к технической биохимии и биотехнологии и может быть использовано в пишевой и микробиологической промышленности для получения иммобили- зированных липаз.

Цель изобретения - повышение каталитической активности иммобилизованной липазы, увеличение ее стабильности в водно- органических средах.

Способ получения сорбента для иммобилизации ферментов заключается в следую- шем.

Полиамид, растворенный в концентрированной НС1, выдерживают с силикагелем в течение 1,5-2 ч при перемешивании, неадсорбированный полиамид удаляют, активируют полученный носитель в 2,0-3,0 н. растворе соляной кислоты при 40-45°С в течение 1;5-2,0 ч. Сорбент промывают водой, уравновешивают с 0,1 М боратным буфером, рН 8,5-9,5, затем модифицируют его глута- ровым диальдегидом при 15-20°С в течение

2 ч. Ковалентное связывание биоспецифического лиганда - кефалина проводят в том же буферном растворе при 2-6°С в течение 24-30 ч.

Пример 1. К 100 г силикагеля марки КСК № 2 со средним диаметром пор 14 нм, удельной поверхностью 338 и размером частиц от 160- до 250 мкм приливают 10 г полиамида, растворенного в концентрированной НС1 (200 мл), выдерживают при перемешивании в течение 2 ч, затем добавляют 40 /о-ный водный ацетон. Надосадочную жидкость удаляют декантацией, сорбент промывают дистиллированной водой до нейтральной среды. Зате.м полученный сорбент активируют 2 н. НС1 при 45°С в течение 2 ч, промывают дистиллированной водой. К влажному сорбенту добавляют 60 мл 0,1 М борат- ного буфера, рН 8,5 содержащего 3,14 мл 25%-ного раствора глутарового альдегида, и оставляют при перемешивании на 2 ч. Несвязавшийся глутаровый альдегид от.мывают

сл

00

сд

500 мл того же буферного раствора. Для присоединения лиганда к модифицированному полиамиду добавляют 60 мл раствора кефа- лина с концентрацией 40 мг/мл в 0,1 М буфере, рН 8,5, содержащем 50% этанола и оставляют при перемешивании на 24 ч при 4°С. Несвязанный кефалин удаляют последовательным промыванием сорбента 500 мл этилового спирта и 500 мл 0,1 М боратного буфера, рН 8,5. Для блокирования оставшихся свободных альдегидных групп к полученному сорбенту добавляют 60 мл 0,1 М боратного буфера, рН 8,5, содержаш,его 3,5 мл этаноламина и оставляют при перемешивании на 24 ч при 4°С. Избыток этаноламина

10

В табл. 2 представлены данные по влиянию соотношения силикагеля и полиамида при синтезе сорбента на удельную активность иммобилизованной липазы на этих носителях.

Из табл. 2 видно, что оптимальным является массовое соотношение носителя и полиамида 10:1.

В табл. 3 приведены данные о влиянии массового соотношения сорбент-лиганд на положительный эффект.

Из представленных результатов видно, что оптимальным является соотношение сорбента и лиганда (кефалина) 10:1.

В табл. 4 представлены данные о влиянии

удаляют промыванием сорбента 30 мл того 15 диаметра пор на каталитическую активность

же буферного раствора.

Пример 1. Синтез сорбента проводят, как в примере 1, с той разницей, что покрытие силикагеля полиамидом проводят в соотношении от 10:0,5 до 10:5.

Пример 3. Синтез сорбента проводят, как в примере 1, но на стадии присоединения лиганда к модифицированному сорбенту количество кефалина в инкубационной смеси составляет от 0,5 до 1,5 г в 60 мл 0,1 М боиммобилизованной липазы.

Наиболее высокая удельная активность наблюдается в том случае, когда в качестве твердой подложки используют кремнеземы 2Q с размером пор не ниже 8-10 нм, но и при 3,2 нм предложенный способ превосходит известный, т.е. мезопористый кремнезем обеспечивает положительный эффект.

В табл. 5 приведены результаты применения иммобилизованных липаз в конкретных

ратном буфере, рН 8,5, содержаш,ем 50% процессах (гидролиз и переацилирование ры

бьего жира и льняного масла) для получения продуктов обогащенными полиеновыми жирными кислотами.

этанола.

Пример 4. Синтез сорбента проводят, как в примере 1, с той разницей, что в качестве твердой подложки используют силикагель со средним диаметром пор 3,2 нм.

Пример 5. Синтез сорбента проводят, как в при.мере 1, с той разницей, что в качестве твердой подложки используют силикагель со средним диаметром пор 8 нм.

В табл. 1 представлена сравнительная характеристика сорбентов, синтезированных предлагаемым и известным способом, при использовании для иммобилизации липазы из гриба.

Из представленных данных в табл. I видно, что иммобилизованная липаза из гриба на предлагаемом сорбенте сохраняет в вод

ной среде высокую (85%) активность, а в случае проведения реакции в водно-ацетоновой среде даже повышает свою активность. При использовании сорбента синтезированных по известным методам иммобилизованная липаза обладает низкой удельной активностью.

В табл. 2 представлены данные по влиянию соотношения силикагеля и полиамида при синтезе сорбента на удельную активность иммобилизованной липазы на этих носителях.

Из табл. 2 видно, что оптимальным является массовое соотношение носителя и полиамида 10:1.

В табл. 3 приведены данные о влиянии массового соотношения сорбент-лиганд на положительный эффект.

Из представленных результатов видно, что оптимальным является соотношение сорбента и лиганда (кефалина) 10:1.

В табл. 4 представлены данные о влиянии

диаметра пор на каталитическую активность

иммобилизованной липазы.

Наиболее высокая удельная активность наблюдается в том случае, когда в качестве твердой подложки используют кремнеземы с размером пор не ниже 8-10 нм, но и при 3,2 нм предложенный способ превосходит известный, т.е. мезопористый кремнезем обеспечивает положительный эффект.

В табл. 5 приведены результаты применения иммобилизованных липаз в конкретных

процессах (гидролиз и переацилирование ры

процессах (гидролиз и переацилирование ры

бьего жира и льняного масла) для получения продуктов обогащенными полиеновыми жирными кислотами.

Для проведения, реакции переацилирова- НИИ к исходным веществам добавляют равное количество (1:1, по массе) фракции жирных кислот с содержанием эйкозопентаено- вых кислот 95%.

Формула изобретения

35

40

Способ получения сорбента для иммобилизации липолитических ферментов, включающий активацию полиамидсодержащего носителя, обработку его глутаровым альдегидом и ковалентное присоединение лиганда, отличающийся тем, что, с целью повышения каталитической активности иммобилизованной на сорбенте липазы и увеличения ее стабильности в водно-органических 45 средах, в качестве носителя используют мезопористый кремнезем с нанесенным полиамидом.

Таблица 1

Изобретение относится к способу получения сорбента для иммобилизации и позволяет повысить каталитическую активность иммобилизованной липазы и увеличить ее стабильность в водно-органических средах. Полиамид растворяют в концентрированной НС1, выдерживают с лизопористым кремнеземом в течение 1,5-2 ч при перемешивании, удаляют неадсорбированный полиамид, активируют в 2,0-3,0 н. НС1 ПРИ 40-45°С В ТЕЧЕНИЕ 1,5-2 Ч. СОРБЕНТ ПРОМЫВАЮТ ВОДОЙ, УРАВНОВЕШИВАЮТ С 0,1 М БОРАТНЫМ БУФЕРОМ РН 8,5-9,5, ЗАТЕМ МОДИФИЦИРУЮТ ЕГО ГЛУТАРОВЫМ АЛЬДЕГИДОМ ПРИ 15-20°С В ТЕЧЕНИЕ 2 Ч. КОВАЛЕНТНОЕ СВЯЗЫВАНИЕ БИОСПЕЦИФИЧЕСКОГО ЛИГАНДА - ПЕФАЛИНА ПРОВОДЯТ В ТОМ ЖЕ БУДЯРНОМ РАСТВОРЕ ПРИ 2-6°С В ТЕЧЕНИЕ 24-30 Ч. 5 ТАБЛ.

Показатели

Удельная активность липаз,

мкмоль/ч на г носителя:

водная среда1101200

25%-ная водпо-спиртовая средаО1000

25%-ная водно-ацетоновая средаО2100

% сохранения активности

после иммобилизации в водной среде2385

Время полуинактивации, мин,

при в 25% спиртовом

растворе2585

Удельная поверхность носителя, м2/г18600-750

Содержание кефалина, мкмоль,

на 1 г сорбента2,2-2,5 0,25-0,28

Адсорбционная емкость

кефалина в ед. липазы

на мкмоль лиганда2305520

Б качестве субстрата используют триглицериды рыбьего жира.

Таблица2

Массовое соотношение

силикагель:полиамид 10:0,1 10:0,5 10:1 10:3 10:5

,г--- ,л 1-л,11м лл-1Л- im - -T.-i., ги1У..м-- -- т-1----.-1-ы-- -и--rij --ти-ч..,1т и---т т.иг-«-Чжг--ч1 --| |Ч г-Удельная активность

МКМОЛЬ/Ч на 1 г

носителя 760 1050 1200 1150 1200

В качестве субстрата используют триглицериды рыбьего жира.

ТаблицаЗ

Массовое соотношение

сорбент:лиганд 20:1 10:1 7:1 4:1

Удельная активность,

мкмоль/ч на 1 г,

носителя1020 1210 1200 1190

Сорбент по Известный

способз

Предлагаемый

Исходное вещество Глубина превращения, % Содержание полиеновых жирных кислот в дигли- церидах, %

Та6лица4

ТаблицаЗ

Льняное масло 25,4 64

52,0

20