Способ определения антител в сыворотке крови Советский патент 1993 года по МПК G01N33/53 

Предлагаемое изобретение относится к области биохимии и иммунологии, может найти применение в ветеринарии и медицине для диагностики различных заболеваний.

Цель изобретения - упрощение способа определения антител. Расширяется также круг определяемых веществ.

Поставленная цель достигается тем, что в исследуемый раствор, содержащий анализируемую сыворотку крови, добавляли конь- югат хлорофоса с денатурированной дезоксирибонуклеиновой кислотой, после перемешивания в течение 15 минут вводили стандартный раствор специфичного субстрата бутирилхолинэстеразы (бутирилХЭ)- бутирилтиохолиниодида (БТХИ) и опускали ферментный электрод на основе иммобилизованной путем включения в пленку из нитрата целлюлозы холинэстеразы, регистрировали осцилловольтамперограмму в интервале потенциалов (-0,1) - (-0,8) В, а концентрацию специфических AT определяли по высоте пика при потенциале -0,55 ±0,05 В.

В предлагаемом способе определения AT в качестве антигена использована денатурированная однониточная дезоксирибонуклеиновая кислота (д-ДНК), которая специфична к аутоантителам, наличие которых в сыворотке крови больного организма характерно для целого ряда аутоиммунных заболеваний.

П р и м е р 1. Получение конъюгата (хлорофос - д-ДНК). Для получения конъюгата 0,0004 г хлорофоса растворяли в 2 мл раствора д-ДНК с концентрацией 0,1 мг/мл (раствор ДНК селезенки крупного рогатого скота в 0,1 М карбонатно-бикарбонатном буфере (рН 9,6) денатурировали кипячением на водяной бане в течение 20 минут с последующим резким охлаждением). После перемешивания в течение 15 минут добавляли 0,06 мл 25%-ного глутарового альдегида марки Резная. Полученный раствор перемешивали 15 мин. Наилучшими свойствами обладает коньюгат следующего состава (мас.%):

00

W N

ю

00

д-ДНК0,0094-0,0096

Хлорофос0,018-0,019

Глутаровый альдегид 4,29-4,30 Карбонатный буфер с рН 9,6Остальное

Для многократного использования дорогостоящего фермента бутирилХЭ использован разработанный нами ранее ферментный электрод на основе холинэсте- разы иммобилизованной в пленке из нитрата целлюлозы (А.с. № 1296913). Использование в данном случае ферментного электрода значительно упрощает проведение ИФАМ, обеспечивает возможность его автоматизации, а также позволяет одновременно проводить высокочувствительную детекцию продукта ферментативного гидролиза специфического субстрата ХЭ - БТХИ. Продукт-тиол - образует меркаптид ртути, который восстанавливается на стационарном ртутно-пленочном электроде с се- ребряной .подложкой (СРПЭ). На осцилловольтамперограммах БТХИ на СРПЭ с серебряной подложкой наблюдается небольшой пик при потенциале -0,55 В относительно насыщенного каломельного электрода, который быстро растет по высоте в присутствии ХЭ. При введении в исследуемый раствор коньюгата, содержащего ингибитор (хлорофос), высота пика уменьшается и зависит от концентрации ингибитора в ячейке, которая, в свою очередь, зависит от степени прохождения иммунологической реакции.

При отсутствии в исследуемом растворе специфических AT коньюгат, содержащий ингибитор, свободно подходит к активным центрам ХЭ и взаимодействует с ними, мешая подходу субстрата, т.е. оказывает обыч- ное ингибирующее действие, что отражается на уменьшении высоты катодного пика при потенциале -0.55 В по сравнению с током пика, зарегистрированным в отсутствие конъюгата. При наличии же в растворе специфических AT благодаря перемешиванию происходит быстрое связывание специфических AT с д-ДНК конъюгата. Так как антитела являются биологическими макромолекулами, то, находясь в иммунном комплексе, они стерически закрывают ингибитор ХЭ, и он не может подойти к активным центрам фермента. Высота пика в данном случае не изменяется.

Предлагаемый способ определения AT с использованием ингибиторногр ИФА был применен для диагностики одного из опасных аутоиммунных заболеваний - алеутской болезни норок, которая характеризуется резким повышением уровня иммуноглобулинов. Диагностику осуществляют следующим образом.

П р и м е р 2. Получение контрольного сигнала. Биосенсорную часть ферментного

электрода помещают на 30 минут при комнатной температуре в 1%-ный раствор бычьего сывороточного альбумина в фосфатном буфере (рН 7,4) для предотвращения неспецифического связывания AT. После

промывки боратным буферным раствором с рН 9,05 ферментный электрод вводят в электрохимическую ячейку с насыщенным каломельным электродом (нас.к.э.). вводят 4,5 мл боратного буферного раствора (рН 9,05) и

5 0,5 мл стандартного раствора БТХИ с концентрацией 1,9 . моль/л. Удаляют кислород в течение 15 минут током водорода и снимают осцилловольтамперограммы в интервале потенциалов (-0,1) - (-0,8) В, U 1

0 в/с, в непрерывном режиме поляризации с треугольной разверткой потенциала. Измеряют высоту катодного пика при потенциале En - 0.55 В.

Примерз. Получение аналитического

5

сигнала в присутствии конъюгата и сыворотки здоровых норок. В электролитическую ячейку с нас.к.э. вводят 4,3 мл боратного буфера (рН 9,05), добавляют 0,2 мл конъюгата и 6 мкл сыворотки здоровых норок. После

0 перемешивания в течение 15 мин добавляют 0,5 мл стандартного раствора БТХИ с концентрацией 1,9 моль/л и опускают ферментный электрод. Все дальнейшие операции проводят как описано выше.

5 п р и м е р 4. Построение зависимости величины тока пика от концентрации AT. В электролитическую ячейку с нас.к.э. вводят 4,3 мл боратного буфера с рН 9,05, добавляют 0,2 мл конъюгата и от 1 до 10 мкл 0 глобулиновой фракции с концентрацией 15 мг/мл, полученной из сыворотки больных норок. После перемешивания в течение 15 мин добавляют 0,5 мл стандартного оаство- ра БТХИ с концентрацией 1,9 моль/л

5 и опускают ферментный электрод. Удаляют кислород в течение 15 мин током водорода или аргона и снимают осцилловольтампе- рограмму в интервале потенциалов от (-0,1) до (-0,8) в ( В/с, .1 В, непрерывный

0 режим поляризации, треугольная развертка потенциала). Измеряют высоту катодного пика при потенциале -0,55 В. Строят зависимость высоты катодного пика от концент- рации AT. Вид этой зависимости

5 представлен на рисунке. Линейная часть зависимости в интервале концентраций от до М в присутствии конъюгата (хлорофос - д-ДНК) может быть использована как градуировочный график для количественного определения AT, что позволяет оценить тяжесть заболевания.

Результаты определения специфических AT представлены в таблице,

П р и м е р 5. Получение аналитического сигнала в присутствии сыворотки крови норок с неизвестным содержанием специфических антител. В электролитическую ячейку с нас.к.э. вводят 4,3 мл боратного буфера с рН 9,05, добавляют 0,2 мл конъю- гата и 6 мкл анализируемой сыворотки. Все дальнейшие операции проводят как описано выше.

Результаты определений могут быть представлены также по положительно-отрицательному методу. Диагностику проводили по разнице величины пиков при потенциале -0,55 В в отсутствие и в присутствии анализируемой сыворотки животных. Эта разница в величинах сигналов составляет не менее 2-3 величин стандартного отклонения величины пиков при потенциале -0,55 В в присутствии сыворотки здоровых животных (нулевого стандарта). Стандартное отклонение составляет в наших условиях 0,1 мкА для . Общее время анализа составляет 1 ч 15 мин.

При проведении серийной диагностики для последующих определений нет необходимости получения контрольного сигнала и сигнала в присутствии сыворотки здоровых норок. Время анализа в данном случае составляет 30 мин,

Для многократного использования ХЭ и возможности автоматизации процесса диагностики разработаны условия реактивации биосенсорной части .ферментного электрода, заингибированной под действием хлорофоса в составе конъюгата. При выдерживании ее в 2 М растворе гидроксиламина в течение 10 мин ферментативная активность (высота пика) возвращается к исходному уровню.

Результаты по диагностике заболеваний, полученные с помощью предлагаемого способа, хорошо согласуются с результатами классического ИФА со спектрофотомет- рической индикацией.

Селективность способа установлена при введении в систему иммуноглобулина С

0

0

5

0

5

0

5

0

5

крупного рогатого скота и лошади, в присутствии которых наблюдается обычный спад тока пика при -0,55 В, как и в случае наличия в анализируемом растворе одного конъюгата без специфических AT.

Чувствительность предлагаемого способа составляет 2,0 ЮМ специфических антител. Ошибка определения составляет менее 4% (в известном способе менее 5%). Отклик электрода наступает практически мгновенно, что позволяет использовать его в режиме датчика по типу красный-зеленый (т.е. присутствуют AT или отсутствуют).

Предлагаемый способ определения AT позволяет проводить диагностику ряда аутоиммунных заболеваний с высокой чувствительностью и селективностью, использовать ХЭ многократно. Работа в кинетическом режиме при перемешивании позволяет сократить время анализа от нескольких часов до 30 мин в случае серийных определений. Возможно также проведение анализа образцов, содержащих примеси крови, поскольку в их присутствии не наблюдается изменение контрольного сигнала.

Формула изобретения Способ определения антител в сыворотке крови путем внесения в ячейку конъюгата модулятора фермента с антигеном, исследуемого образца, фермента, перемешивания смеси, добавления субстрата с последующей регистрацией и расчетом концентрации антител, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа при определении аутоиммунных антител в сыворотке крови норок, в качестве коньюгата модулятора фермента с антигеном используют коньюгат хлорофоса с денатурированной ДНК, в качестве фермента - бутирилхолинэстеразу, в качестве субстрата - бутирилтиохолинио- дид, перемешивание смеси проводят в тече- ние 1.5 мин до внесения субстрата, регистрацию осуществляете помощьюфер- ментного электрода при потенциале 0,55 ± ± 0,05 В осцилловольтамперограммы записывают в интервале потенциалов (-0,1) - (-0,8) В, а концентрацию антител рассчитывают по высоте пика.

Использование: в области биохимии и иммунологии. Сущность, изобретения: в сыворотку крови норок добавляют коньюгат хлорофоса с денатурированной дезоксори- бонуклеиновой кислотой, после перемешивания в течение 15 мин вводят стандартный раствор специфичного субстрата холинэсте- разы - бутирилтиохолиниодидэ и опускают ферментный электрод с иммобилизованной в пленке из нитрата целлюлозы холинэсте- разой, регистрируют осцилловольтамперо- грамму в интервале (-0,1) - (-0,8) В, а концентрацию специфичных антител определяют по высоте пика при потенциале -0,55 ± 0,05 В.