Изобретение относится к медицине а именно к кардиологии.
Известно, что для осложненного течения ишемической болезни сердца (ИБС) характерен либо дефицит, либо избыток эндорфинов, энкефалинов.
Цель изобретения - ускорение способа прогноза.
Эта цель достигается тем, что из сыворотки крови выделяется спиртоводорастворимая фракция, содержащая комплекс пептидов. Проводится ее тестирование на культуре клеток инфузории туфельки в присутствии физиологического раствора (контроль) и растворов лечебных концентраций пептида дельта сна (ПДС) и/или синтетического аналога лей-энкефалина-даларгина. Добавляемые пептиды известны как стресс-лимитирующие и цитопротекторные. В зависимости от осложнений ИБС, индивидуальной реакции организма, они могут: устранять токсичность; усиливать ее; не влиять на нее, что определяется по разнице времени парамецитной реакции (ВПР) между контролем и опытом. В результате характеризуются биологические свойства изучаемой совокупности пептидов. При устранении токсичности констатируется в тестируемой пробе дефицит цитопротекторных стресс-лимитирующих пептидов, при усилении - их избыток, при отсутствии влияния - их физиологическое содержание.
Предлагаемый способ обладает новизной и существенными отличиями, заключающимися в быстром и удобном определении биологических свойств совокупности циркулирующих пептидов сыворотки крови, связанных с относительными или абсолютными изменениями в системе стресс-лимитирующих цитопротекторных пептидов. Он основан на оригинальном подходе - улавливании особями парамеций изменений в активности континуума спиртоводорастворимых пептидов конкретного обследованного больного или животного. Если в пептидном континууме избыток естественных аналогов добавляемых веществ, то состояние культуры может ухудшится. Если они в дефиците (абсолютном или относительном, по сравнению с антагонистами), то состояние культуры в опыте становится лучше, чем в контроле.
Пример конкретного выполнения.
Краткая выписка из истории болезни N 14772 больного С. , 47 лет. Поступил в ГКБСМП г. Воронежа 20.09.89 с диагнозом повторного заднего крупноочагового инфаркта миокарда (ИМ), установленного по общепринятым критериям. Заболевание протекало неблагоприятно. Сохранялась стенокардия, 8.10.89 развился рецидив ИМ с частой желудочковой экстрасистолией. Больной получал общепринятую терапию, лидокаин, но состояние не улучшалось. Решено оценить биологические свойства совокупности циркулирующих пептидов, так как имеющееся течение заболевания теоретически могло быть связано с дефицитом стресс-лимитирующих пептидов. У больного утром натощак до введения лекарств взята венозная кровь, 0,04 мл сыворотки крови соединили в центрифужной пробирке с 3,2 мл предварительно охлажденного 96о этилового спирта. Пробирку инкубировали при 4оС 15 мин после взбалтывания смеси, затем центрифугировали 10 мин при 1000 об. /мин. Надосадок переливали в чистую чашку Петри, высушивали (при комнатной температуре к утру следующего дня или в вакуумной сушилке за десятки минут). Полученный осадок разводили в 1,2 мл физраствора. Ожидали 5 мин растворения водорастворимых компонентов. Полученную жидкость центрифугировали 10 мин при 1000 об. /мин. Супернатант по 0,02 мл в виде капель помещали на предметное стекло. В первую каплю (контроль) добавляли 0,01 мл физраствора, во вторую - 0,01 мл раствора ПДС (с концентрацией 0,2 мг/л), в третью - 0,01 мл раствора даларгина (0,8 мг/л). Затем в каждую каплю, начиная с третьей, добавляли культуральную среду с 30-40 особями инфузорий. Отмечали время 100% гибели инфузорий в каждой капле (ВПР). В контроле оно оказалось равным 8 мин, а с ПДС - 11 мин, с даларгином - 10 мин. По сравнению с нормами, констатировалась токсичность пробы и стимулирующий эффект цитопротекторных пептидов, что характерно для неблагоприятного течения ИБС, которое может быть связано с дефицитом защитных пептидов. Продолжавшаяся общепринятая терапия не устранила его, так как проведенное повторное исследование 25.10.89 привело к аналогичным результатам. Пациенту назначен плазмаферез - 3 сеанса с интервалом в 2 дня с забором по 1 мл плазмы, с замещением донорcкой плазмой, реополиглюкином, физраствором. После каждого сеанса проверяли характер токсичности пептидов сыворотки крови по описанному способу. Параллельно с улучшением состояния больного отмечалось исчезновение токсичности и стимулирующего эффекта стресс-лимитирующих пептидов.
Пример демонстрирует связь неблагоприятного течения ИБС с биологическими особенностями совокупности циркулирующих пептидов сыворотки крови и связь ремиссии с их устранением методом плазмафереза.
Как показал хроматографический анализ, спиртоводорастворимая фракция (СВФ) крови содержит, в основном, пептиды, в том числе регуляторные - энкефалины и эндорфины, пептид дельта-сна, ангиотензин и др. , аминокислоты, частично, электролиты. В связи с плохой растворимостью в ней содержатся лишь следовые количества катехоламинов, гистамина, серотонина. Показана также токсичность данного комплекса при неблагоприятном течении ИБС, связь токсичности с пептидами молекулярной массы от 700 до 1000 дальтон. Удлинение ВПР при добавлении ПДС и/или даларгина в конечных концентрациях 0,05 и 0,2 мг/л соответственно расценивали как стимуляцию культуры пептидами (СП), а укорочение - угнетением пептидами (УП). Серия предварительных исследований показала, что данные концентрации максимально стимулируют ВПР. Использовали ПДС, синтезированный в ВНИИ биохимии АМН СССР. Даларгин получен на опытном производстве ВКНЦ АМН СССР.
Названные концентрации давали неспецифическую стимуляцию ВПР для инфузорий, помещенных, в физиологический раствор, на 1/3-1/4 продолжительности ВПР, по сравнению с контролем, где вместо ПДС и даларгина использовали добавку физраствора. ПДС и даларгин обладают неспецифическим защитным действием. Они - цитопротекторы для инфузорий, помещенных в неестественную среду - физиологический раствор. Однако в данной ситуации продлить жизнь инфузориям могли бы многие вещества. Цитопротекторные свойства даларгина известны.
Предложенный авторами тест проведен на 268 человеках: 50 здоровых донорах крови, 186 больных разными формами ИБС, 12 - с другими заболеваниями миокарда (миокардиты, миокардический кардиосклероз, ревматизм с пороками). 15 пациентов страдали гипертонической болезнью и артериальной гипертонией на фоне латентнотекущего пиелонефрита. У 10 пациентов имелась тяжелая несердечная патология (острое нарушение мозгового кровообращения, сепсис, рак, печеночная, почечная недостаточность). Все они умерли через несколько часов-дней после обследования от асистолии или остановки дыхания без предшествующих нарушений ритма, проводимости, повышения АД. Пациенты были обоего пола, в возрасте от 36 до 82 лет, доноры от 18 до 45 лет. Не включая больных с психическими и эндокринными заболеваниями (кроме компенсированного сахарного диабета), с другими сопутствующими тяжелыми заболеваниями. Среди пациентов с ИБС имелись лишь единичные случаи стабильной артериальной гипертензии, в связи с возможным ее влиянием на изучаемые параметры. Диагностику патологии производили на основании общепринятых критериев. Все больные получали общепринятую терапию, кроме 20, у которых дополнительно осуществляли плазмафорез. Больных обследовали при поступлении в стационар, затем в динамике 2-8 раз. Повторность обусловливалась развитием осложнений, их течением. Забор крови проводили утром натощак, до введения лекарств. Исключение составили часть ургентных больных, у которых забирали кровь на максимально отсроченном после введения препаратов интервале и проводили специальный анализ предшествующий терапии.
Как видно из табл. 1 и 2, у здоровых доноров УП не наблюдалось, СП выявлялась редко и была слабой. Слабой СП и УП считали разницу ВПР между опытом и контролем до 2 мин. Разницу до 1 мин не учитывали как возможную погрешность метода. Выраженной считали СР, УП от 3 мин и более. Отсутствие СП у здоровых объясняли наличием в их СВФ естественных ПДС и лей-энкефалина, других цитопротекторных пептидов. Увеличение их концентрации за счет синтетических аналогов обычно не усиливало их эффект. Увеличение концентрации ПДС и даларгина в тесте с физраствором в 10 и более раз также не давало усиления защитного эффекта. У больных СП, УП сопоставляли с токсичностью СВФ. У здоровых ВПР колебалось в пределах 14-20 мин. Токсичными считали пробы при ВПР ниже 13 мин. Сопоставление токсичности проб и СП, УП показало, что для нарушений ритма характера СП, для шоков - токсичность с УП. Форма ИБС (с наличием инфаркта разной обширности или без) для СП, УП значения не имела. ПДС и даларгин в тесте действовали однонаправленно, но при аритмиях, фибрилляции СП с ПДС была более яркой, превышая более, чем на 100% , контрольное время. При атриовентрикулярных блокадах II-III степеней наблюдалась УП на фоне повышенного ВПР, т. е. СП и УП являлись самостоятельными характеристиками, несущими дополнительную информацию о биологических свойствах тестируемых пептидов, кроме общепринятой характеристики - токсичности. СП наблюдалась и при неишемических заболеваниях миокарда с аритмиями, а УП была характерна для 10 пациентов, умерших от асистолии на фоне прогрессирования тяжелых несердечных заболеваний. В целом выраженная СП наблюдалась при тех состояниях, когда радиоиммунными методами другие авторы выявили дефицит стресс-лимитирующих пептидов - при аритмиях, угрозе фибрилляции, а УП - при шоках, когда имеется их избыток. Учитывая данную зависимость, можно видеть, что предложенный авторами простой метод может характеризовать биологические свойства тестируемой совокупности пептидов с позиции возможного дефицита или избытка стресс-лимитирующих пептидов у обследованного. Именно относительному дефициту стресс-лимитирующих пептидов придается большое значение в развитии тяжелых осложнений при заболеваниях миокарда. Определить же его биохимически крайне сложно. Поэтому использование биотестов в такой ситуации может быть весьма целесообразным. (56) Терапевтический архив, 1988, N 5, с. 92-94.
Использование: медицина, в частности кардиология. Сущность изобретения: к пробе сыворотки крови добавляют охлажденный до 4С 96этиловый спирт в соотношении 1 : 8, смесь инкубируют при 4С 15 мин, центрифугируют 10 мин при 1000 об/мин, надосадочную жидкость собирают и высушивают, сухой остаток растворяют в физиологическом растворе, по объему превышающем в 3 раза исходный объем сыворотки, раствор центрифугируют при 1000 об. /мин 10 мин, затем полученный супернатант помещают в виде капель по 0,02 мл каждая на предметное стекло с последующим добавлением к первой капле 0,01 мл физраствора, ко второй - 0,01 мл пептида дельта-сна в конечной концентрации 0,05 мг/мл, к третьей - даларгин в конечной концентрации 0,2 мг/мл, после чего дополнительно в каждую каплю добавляют 0,01 мл культуры клеток инфузории туфельки для определения времени парамецийной реакции и при отклонении значения этого показателя в двух последних каплях, по сравнению с первой, прогнозируют неблагоприятное течение ишемической болезни сердца. 2 табл.
СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ТЕЧЕНИЯ ИШЕМИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНИ СЕРДЦА, включающий исследование пробы крови, отличающийся тем, что к пробе сыворотки крови пациента добавляют 96o-ный этиловый спирт, охлажденный до 4oС, в соотношении 1 : 8, смесь инкубируют в течение 15 мин при 4oС, затем центрифугируют в течение 10 мин при 1000 мин-1, надосадочную жидкость собирают, высушивают, сухой остаток растворяют в физиологическом растворе в объеме, в 3 раза превышающем исходный объем сыворотки, повторно центрифугируют, надосадочную жидкость собирают, помещают в виде капель объемом 0,02 мл каждая на предметное стекло с последующим добавлением к первой капле 0,01 мл физиологического раствора, к второй - 0,01 мл раствора пептида дельта-сна в конечной концентрации 0,05 мг/мл, к третьей - 0,01 мл раствора даларгина в конечной концентрации 0,2 мг/мл, затем дополнительно каждой капле добавляют по 0,01 мл культуры клеток инфузории-туфельки с последующим определением времени парамецийной реакции и при отклонении значения этого показателя в двух последних каплях в сравнении с первой прогнозируют неблагоприятное течение заболевания.
