СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РАЗВИТИЯ ДЕЛЬТА-ВИРУСНОЙ СУПЕРИНФЕКЦИИ У БОЛЬНЫХ С ХРОНИЧЕСКИМИ ДИФФУЗНЫМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ ПЕЧЕНИ Российский патент 1994 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, а именно к гастроэнетерологии и инфекционным болезням, и может быть использовано, в частности, для прогнозирования дельта-вирусной суперинфекции у больных хроническими гепатитами и циррозами печени.

Из практики медицины известны способы прогнозирования дельта-вирусной инфекции, состоящие в диагностике Hвs-антигена у данной группы больных (Н. П. Блохина. Хронический гепатит дельта (клиника, диагностика, лечение)", автореферат дисс. докт. мед. наук, Москва, 1989 г. ; Colombo M. , Cambieri R. , Rumi M. G. et al. "Long-term delta superinfection im hepatitis B surface antigen carriers and its relationship to the course of chromic hepatitis B". Gastroenterology. 1983. v. 85, p. 235-239.

Наиболее близким к предлагаемому является способ Е. С. Кетиладзе и др. Дельта-инфекция у больных хроническим вирусным гепатитом В. - Вопр. вирусологии, 1986, N 1, с. 69-73), состоящий в том, что проводилась идентификация Hвs-антигена у больных с хроническими диффузными заболеваниями печени.

Однако известный способ имеет следующие недостатки:
- обладает незначительной точностью, так как позволяет прогнозировать дельта-вирусную суперинфекцию только у небольшой части больных из-за того, что не учитывается состояние иммунной системы организма;
- обладает незначительной чувствительностью, так как практически у каждого носителя Нвs-антигена может развиться суперинфекция дельта-вирусом;
- не позволяет определить группы с высоким риском суперинфицирования дельта-вирусом и резистентных к нему, так как не учитывает индивидуальных особенностей организма у носителей Нвs-антигена;
- не обладает стабильностью, так как зависит от чувствительности методов исследования Нвs-антигена.

Целью изобретения является повышение точности способа прогнозирования дельта-вирусной суперинфекции у лиц с хронической Нвs-антигенположительной патологией печени. Указанная цель достигается тем, что исследуют тканевые антигены системы HLA на лимфоцитах периферической крови и по наличию HLA-B8, B35 или их сочетания прогнозируют возможность дельта-вирусной суперинфекции, а при наличии HLA-B18 - резистентность к ней.

Авторами проведено исследование тканевых антигенов системы HLA у 67 больных с хроническими диффузными заболеваниями печени. Из них у 43 обследованных был диагносцирован цирроз печени, у 24 - хронический активный гепатит. У 51 обследованного в сыворотке крови определялся положительный Нвs-антиген, что составило 70% от числа всех обследованных.

Все больные были обследованы на наличие в сыворотке крови дельта-вирусных антител классов G и М методом иммуноферментного анализа с помощью коммерческого набора сывороток, выпускаемых ГМП "Препарат" Горьковского НИИЭМ МЗ РСФСР. У 29 больных с хронической патологией печени Нвs-антигенпозитивных выявлены антитела к дельта-вирусу, что составило 45% от числа всех обследованных и 57% от числа носителей Нвs-антигена.

У всех больных с хроническими диффузными заболеваниями печени проводилось типирование тканевых антигенов системы HLA, локусов А и В, методом комплементзависимой цитотоксичности с применением набора типирующих антисывороток Ленинградского НИИ гематологии и переливания крови.

Результаты обследования показали, что распределение большинства антигенов HLA, локусов А и В, у больных с дельта-вирусной суперинфекцией достоверно не отличалось от такового у больных с хроническими диффузными заболеваниями печени, в том числе носителей Нвs-антигена без дельта-вирусной инфекции.

В то же время антигены HLA-B8 и В35 регистрировались значительно чаще в группе больных с дельта-вирусной суперинфекцией, чем в группе больных-носителей Нвs-антигена, у которых не были выявлены антитела к дельта-вирусной инфекции (соответственно для HLA-B8: 41,4% , против 4,5% ; р < 0,005; для HLA-B35: 37,9% против 13,6% ; р < 0,01). Напротив, антиген HLA-B18 в группе больных с дельта-вирусной суперинфекцией встречался значительно реже, чем у больных - носителей Нвs-антигена без дельта-вирусной суперинфекции (соответственно 10,3% против 63,6% ; р < 0,001).

Полученные данные суммированы в таблице.

Таким образом, при наличии у больных с хронической Рвs-антигенположительной патологией печени антигенов HLA-B8 и В35 суммарная частота дельта-вирусной суперинфекции составила 70% . В трех случаях имелось сочетание антигенов HLA-В8, В35. Следовательно, лица с хроническими диффузными заболеваниями печени, Нвs-антиген положительные, в фенотипе которых имеется наличие HLA-B8, B35 или их сочетание, имеют высокий риск развития дельта-вирусной суперинфекции. Наличие же у больных с хроническими диффузными заболеваниями печени, Нвs-антигенположительных, в фенотипе антигена HLA-B18 обусловливают резистентность к развитию дельта-вирусной суперинфекции.

Предлагаемый способ прошел успешную апробацию на 67 больных в гастроэнтерологическом отделении I областной клинической больницы г. Астрахани в течение 1990-1991 гг.

Ниже приводятся результаты апробации.

П р и м е р 1. История болезни N 19973, Больная У. , 62 года, находилась на лечении в гастроэнтерологическом отделении I областной больницы с 12.11.90 по 14.12.90 с диагнозом: цирроз печени вирусной этиологии, активный. Портальная гипертензия. Асцит. Гиперспленизм II степени. При обследовании отмечалось значительное повышение уровня аминотрансфераз, билирубина, тимоловой пробы, j-глобулинов. В сыворотке крови был определен положительный Нвs-антиген методом иммуноферментного анализа. При гистологическом исследовании биоптата печени диагносцирован цирроз печени с выраженной активностью.

Идентификация антигенов системы HLA, локусов А и В, осуществлялась путем исследования лимфоцитов периферической крови с помощью лимфоцитотоксической реакции. Принцип метода заключался в двухэтапном воздействии на лимфоциты в начале иммунной сывороткой, содержащей антитела известной специфичности, а затем - комплемента. Для выявления антигенов HLA были использованы наборы типирующих антисывороток Ленинградского НИИ гематологии и переливания крови. Забор крови осуществлялся без применения шприца с помощью игл для инъекций. Венозную кровь в объеме 4-5 мл собирали во флакон с плоским дном и дефибринировали с помощью четырех стеклянных бусинок диаметром 6 мм в течение 10 мин. Дефибринированную кровь в объеме 4 мл осторожно наслаивали на 2 мл раствора верографина-фикола плотностью 1,075, предварительно помещенного в центрифужную пробирку, и центрифугировали при 3500 оборотах в 1 мин в течение 20 мин. Образовавшуюся взвесь - "облачко" лимфоцитов переносили в другую центрифужную пробирку, смешивали с 5 мл раствора Хенкса и центрифугировали в течение 10 мин. Удалив надосадочную жидкость, доводили концентрацию отмытых лимфоцитов до 2-4˙ 10³ на 0,001 мл с помощью раствора Хенкса. Полученную лимфоцитарную взвесь раскапывали микрошприцем Гамильтона по 1 мкл в лунки планшет Терасаки с предварительно раскапанными туда же типирующими анти-HLA-сыворотками и инкубировали при комнатной температуре в течение 45 мин. После этого в каждую лунку планшета добавляли по 5 мкл комплемента - сыворотки крови кроликов и снова инкубировали в течение 60 мин при комнатной температуре. По истечению указанного времени планшет резко встряхивали, удаляя вазелиновое масло, и закапывали в лунки по 1 мкл красителя - смеси 1% водного раствора трепана голубого с 4,26% -ым гипертоническим раствором хлористого натрия в соотношении 4: 1. Избыток красителя через 4-5 мин удаляли встряхиванием и проводили оценку результатов под микроскопом при увеличении 10 х 20.

Лимфоциты, имеющие определенную специфичность, взаимодействовали с иммунной HLA-сывороткой, вызывая реакцию клеточного лизиса, которая определялась по проникновению в клетку красителя. Интенсивность реакции оценивалась по количеству лизированных и окрашенных клеток. В случае гибели 100-75% лимфоцитов реакция считалась резко положительной и оценивалась в четыре плюса, при гибели 75-50% клеток она оценивалась как положительная и обозначалась тремя плюсами, при гибели 50-25% лимфоцитов - как слабоположительная (два плюса), и при наличии 25-10% - результат расценивался как сомнительный. Иммунные анти-HLA-сыворотки раскапывались в две планшеты Терасаки. На одной определялись антигены, детерминированные локусом А: HLA-A1, A2, A3, A9, A10, A11, A19, A23, A24, A25, A26, A28, A29, A30, A31, A32, A33. На другой - антигены локуса В: HLA-B5, B7, B8, B12, B13, B14, B15, B16, B17, B18, B21, B22, B27, B35, B37, B38, B39, B40 и B41.

При типировании антигенов системы HLA у больной У. был идентифицирован следующий набор антигенов: A1, A19, B8, B12. Учитывая наличие у больной цирроза печени с положительным Нвs-антигеном и антигена HLA-B8, было высказано предположение о возможности наличия дельта-вирусной суперинфекции. Было проведено тестирование антител классов G и М к дельта-вирусу иммуноферментным методом коммерческого набора сывороток, выпускаемых ГМП "Препарат" Горьковского НИИЭМ МЗ РСФСР. В сыворотке крови были выявлены антитела классов G и М к дельта-вирусу, что подтвердило у больной с Нвs-положительным циррозом печени наличие дельта-вирусной суперинфекции. Таким образом, выявление HLA-B8 у больной с Нвs-положительным циррозом печени позволило с высокой вероятностью прогнозировать дельта-вирусную суперинфекцию.

П р и м е р 2. История болезни N 7345. Больной З. , 55 лет, находился на обследовании и лечении в гастроэнтерологическом отделении I областной больницы с 5.05.90 по 12.06.90 с диагнозом: цирроз печени вирусной этиологии, активный. Портальная гипертензия. Гиперспленизм II степени. Наряду с выраженной клинической симптоматикой при обследовании отмечалось значительное повышение уровня ферментов крови, билирубина, осадочных проб. В сыворотке крови определялся положительный Нвs-антиген. Диагноз подтвержден биопсией печени. При типировании антигенов системы HLA по описанной методике были идентифицированы следующие антигены: A1, A3, B8, B27. По наличию антигена HLA-B8 была заподозрена возможность дельта-вирусной суперинфекции, что и было подтверждено при определении антител классов G и М к дельта-вирусу.

П р и м е р 3. История болезни N 1595. Больной И. Находился на обследовании и лечении в гастроэнтерологическом отделении I областной больницы г. Астрахани с 7.02.90 по 28.02.90 с диагнозом: цирроз печени вирусной этиологии, микронодулярный, активность III степени. Портальная гипертензия. Варикоз вен пищевода. Гиперспленизм I степени. На фоне быстропрогрессирующего процесса с выраженной клинической симптоматикой отмечалось значительное повышение уровня АЛТ, АСТ, J-ГТП, тимоловой пробы, щелочной фосфатазы, иммуноглобулинов. В сыворотке крови определялся положительный Нвs-антиген. При гистологическом исследовании биоптата печени диагносцирован мелкоузловой цирроз с выраженной паренхиматозной и стромальной активностью. Набор антигенов системы HLA составил А2. . . В13 В35. По наличию в фенотипе больного антигена HLA-B35 было высказано предположение о наличии у него дельта-вирусной суперинфекции. В результате определения антител к дельта-вирусу был получен положительный результат. Таким образом, выявление антигена HLA-B35 у больного с циррозом печени, носителем Hвs-антигена, с высокой вероятностью позволило прогнозировать дельта-вирусную суперинфекцию.

П р и м е р 4. История болезни N 4883. Больной У. , 53 года, находился на обследовании и лечении в гастроэнтерологическом отделении 1 областной больницы г. Астрахани с 5.04.91 по 26.04.91 г. с диагнозом: хронический активный гепатит вирусной этиологии, Нвs-антигенпозитивный. При обследовании была выявлена высокая активность АЛТ, АСТ, J-ГТП, повышение содержания билирубина, щелочной фосфотазы, гаммаглобулинов, определялся положительный Нвs-антиген. При типировании антигенов системы HLA был идентифицирован набор следующих антигенов: A1 A19 B8 B35. По наличию сочетания антигенов HLA-B8 и В35 в фенотипе было заподозрено наличие дельта-вирусной суперинфекции. Было проведено определение антител классов G и М к дельта-вирусу. Реакция дала положительный результат. Так, по наличию в фенотипе больного с хроническим активным гепатитом, носителя Hвs-антигена, сочетания антигенов HLA-B8 и В35 с высокой вероятностью было прогнозировано наличие дельта-вирусной суперинфекции.

П р и м е р 5. История болезни N 12007. Больной В. 57 лет, находился на обследовании и лечении в гастроэнтерологическом отделении I областной больницы с 22.09.90 по 17.10.90 с диагнозом: цирроз печени вирусной этиологии, активный, декомпенсированный. Портальная гипертензия. Варикозное расширение вен пищевода. Наряду с высокими показателями активности аминотрансфераз и J-ГТЦ отмечалось повышение билирубина, щелочной фосфотазы, уровня иммуноглобулинов, ускорение СОЭ. В сыворотке определялся положительный Нвs-антиген. Набор антигенов HLA составил А1, А19, В12, В18. По наличию в фенотипе HLA-B18, несмотря на высокую степень активности цирроза, было высказано предположение об отсутствии у больного дельта-вирусной суперинфекции. Определение антител классов G и М к дельта-вирусу дало отрицательный результат. Таким образом, по наличию в фенотипе больного с хроническим активным гепатитом, носителя Нвs-антигена, специфичности HLA-B18 c высокой вероятностью была прогнозирована резистентность к дельта-вирусной инфекции.

П р и м е р 6. История болезни N 2460. Больной С. 57 лет, находился на обследовании и лечении в гастроэнтерологическом отделении I областной больницы г. Астрахани с 24.02.91 по 16.04.91 с диагнозом: цирроз печени вирусной этиологии, активный. Портальная гипертензия, осложненная кровотечением из варикозно расширенных вен пищевода. При биохимическом исследовании отмечались высокие цифры АЛТ, АСТ, J-ГТП, билирубина, щелочной фосфотазы, повышение содержания гаммаглобулинов, иммуноглобулинов, увеличение тимоловой пробы, ускорение СОЭ. В сыворотке крови определялся положительный Нвs-антиген. Диагноз был подтвержден данными биопсии печени. Набор антигенов HLA составил А1, А2, В16, В18. По наличию антигена HLA-B18 было высказано мнение об отсутствии дельта-вирусной суперинфекции несмотря на быстропрогрессирующее течение цирроза, его высокую активность и осложнения. Определение антител к дельта-вирусу дало отрицательный результат. Так, по наличию в фенотипе больного с циррозом печени, носителя Нвs-антигена, специфичности HLA-B18 с высокой вероятностью была прогнозирована резистентность к дельта-вирусной суперинфекции.

Предлагаемым способом достигается повышение его точности по сравнению с прототипом, так как позволяет выделить группу риска развития дельта-вирусной суперинфекции среди больных с хронической Нвs-антигенположительной патологией печени.

Преимуществом способа является то, что он позволяет выявлять как группу с высоким риском развития дельта-вирусной суперинфекции, так и группу лиц, резистентных к ней.

Предложенный способ обладает более высокой избирательностью, так как учитывает индивидуальные особенности организма.

Предлагаемый способ нацеливает на проведение более тщательного поиска Hвs-антигена у больных с хроническими диффузными заболеваниями печени при наличии в фенотипе у них антигенов HLA-B8, B35 и B18 за счет повышения чувствительности методов определения Нвs-антитела, так как имеется корреляция между антигенами HLA и носительством Нвs-антигена; исключается необходимость повторного исследования антигенов HLA, так как в течение жизни сохраняется его постоянство. (56) Кетиладзе Е. С. и др. Дельта-инфекция у больных хроническим вирусным гепатитом В. - Вопр. вирусологии, 1986, N 1, с. 69-73.

Изобретение относится к медицине, а именно к гастроэнтерологии и инфекционным заболеваниям, и может быть использовано, в частности, для прогнозирования дельта-вирусной суперинфекции у больных хроническими гепатитами и циррозами печени. Целью предлагаемого способа является повышение точности его. Поставленная цель достигается в изобретении путем исследования на лимфоцитах периферической крови тканевых антигенов системы HLA и по наличию HLA - B8, B35 или их сочетании прогнозируют возможность развития дельта-вирусной суперинфекции, а при наличии HLA - B18 - резистентность к ней. 1 табл.

СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РАЗВИТИЯ ДЕЛЬТА-ВИРУСНОЙ СУПЕРИНФЕКЦИИ У БОЛЬНЫХ С ХРОНИЧЕСКИМИ ДИФФУЗНЫМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ ПЕЧЕНИ путем выявления Hb_S антигена в крови, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа, у лиц с хронической Hb_S-антигенположительной реакцией дополнительно исследуют на лимфоцитах тканевые антигены системы HLA локусов А и В и при наличии HLA - B8, В35 или их сочетания прогнозируют развитие дельта-вирусной суперинфекции, а при наличии HLA - B18 - резистентность к ней.