СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ОСОБЕННОСТЕЙ ТЕЧЕНИЯ ХРОНИЧЕСКОГО ГЕПАТИТА В У БОЛЬНЫХ ГЕМОБЛАСТОЗАМИ Российский патент 2003 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к области медицины, а именно к гастроэнтерологии и гематологии, и может быть использовано, в частности, для прогнозирования особенностей течения хронического гепатита В(ХГВ) у больных гемобластозами.

Из практики медицины известен только один способ прогнозирования хронического гепатита В (Сочнев А.М., Алексеев Л.П., Тананов А.Т. Антигены системы HLA при различных заболеваниях и трансплантации. - Рига: Зинатзе, 1987 г. - 86с.), заключающийся в определении антигенного профиля системы HLA.

Недостатком этого способа является то, что способ известен только у больных хроническими диффузными заболеваниями печени (ХДЗП). Больные гемобластозами с хроническим гепатитом В имеет существенные отличия от больных ХДЗП (состояние иммуносупрессии, множество переливаний крови, массивная медикаментозная нагрузка) и применить известный способ прогнозирования ХГВ, не представляется возможным.

Цель предлагаемого изобретения: повышение точности прогнозирования особенностей течения хронического гепатита В у больных гемобластозами.

Поставленная цель в изобретении достигается тем, что в венозной крови определяют антигены локусов А, В, С системы HLA и при наличии антигена HLA-B35 прогнозируют хронический гепатит В и гемобластоз; при наличии антигена HLA-B40 прогнозируют хронизацию гепатита В; при наличии гаплотипа А2/В27 прогнозируют резистентность к инфицированию вирусом гепатита В.

Успехи в диагностике и лечении вирусных гепатитов, достигнутые за последнее десятилетие, показали важность ранней диагностики, возможность излечения и прогнозирования исходов гепатитов.

Прогнозирование характера течения и исходов заболеваний является важным направлением современной медицины. Одним из достоверных способов, позволяющих определить предрасположенность и особенности течения заболевания, является исследование антигенов системы HLA.

Больные гемобластозами являются особой группой больных, для которой проблема прогнозирования течения особенностей хронического гепатита выходит на одно из ведущих мест. Хронический гепатит В у больных гемобластозами часто наслаивается на уже имеющиеся специфическое и лекарственное поражение печени. Ранняя диагностика гепатита В затрудняется отсутствием яркой клинической симптоматики, основные клинико-лабораторные синдромы хронического гепатита В перекрываются клиникой лейкоза. Состояние иммуносупрессии способствует развитию латентных субклинических форм хронического гепатита В. В то же время, риск заражения вирусом гепатита В у больных гемобластозами достаточно велик вследствие массивной гемотрансфузионной нагрузки и множества инвазивных вмешательств. Таким образом, это дает основание для применения способа прогнозирования особенностей течения хронического гепатита В при гемобластозах.

Представленным способом апробировано 106 больных гемобластозами на базе гематологического отделения Александро-Мариинской I областной клинической больницы г. Астрахани в период с 1996 по 2000 годы.

При обработке полученных результатов были применены методы медицинской статистики. Для оценки результатов типирования антигенов HLA вычислялись частоты антигенов, на основе закона Харди-Вайнберга. Для определения показателя достоверности результатов был использован непараметрический критерий - X².

Критерий X² вычислялся по формуле Holdene, учитывая малый объем выборок, была применена модифицированная формула с поправкой Иейтса. Значения Х², превышающие 3,841 (что соответствует р<0,05) рассматривался, как показатель достоверной разницы между частотами в сравниваемых группах. Для повышения точности исследования проводилась коррекция значения "р" по способу Бонферрони (т.е. умножением величины "р" на число антигенов).

Помимо показателя статистической достоверности, использовался показатель силы ассоциации - RR (relative risk)- относительный риск. Величина RR, равная 1, указывает на отсутствие ассоциации. RR>1 (положительная ассоциация), означает, что антиген чаще встречается у больных; если RR<1, это указывает на снижение частоты антигена у больных. При вычислении RR, учитывая малый объем выборок, была применена модифицированная формула для малых выборок.

Частоты гаплотипов HLA вычислялись непрямым методом, с использованием показателя степени неравновесного сцепления по формуле Маттиуса.

Все расчеты проводились на персональном компьютере IBM Pentium-100, с использованием стандартных статистических программ.

106 больных гемобластозами русской национальности, находившихся на лечении в гематологическом отделении I ОКБ прошли полное клинико-лабораторно-инструментальное обследование на выявление признаков поражения печени вирусом гепатита В. Формирование группы происходило с использованием метода случайного подбора, в исследование включались как больные, имеющие признаки поражения печени (повышение уровня АЛТ, билирубина, гепатомегалия), так и больные, у которых данных симптомов не наблюдалось. Всем больным данной группы проводилось типирование антигенов системы HLA методом комплементзависимой цитотоксичности. Контрольная группа - 200 здоровых доноров русской национальности жителей Астраханской области и 30 больных русской национальности ХДЗП HBsAg+.

На фиг. 1 представлен сравнительный анализ различия частоты регистрации антигенов HLA у больных гемобластозами с маркерами HBV-инфекции и без маркеров. В результате проведенного анализа установлено, что у больных гемобластозами, имеющих маркеры HBV, имеется достоверное повышение антигенов HLA-A10, A28, В21, В22, В35, В40. Антиген-НLА-В27: достоверно повышен у больных гемобластозами без HBV. Так как больные данной группы имеют два основных заболевания - гемобластоз и вирусный гепатит В, нами предпринята попытка определить, какое именно заболевание маркируют данные антигены или имеет место описанная многими авторами способность одного антигена HLA быть маркером нескольких заболеваний. Нами был проведен анализ распределения антигенов HLA у больных ХДЗП HBsAg+ и у больных гемобластозами, имеющих маркеры HBV.

Как следует из фиг.2, наибольший процент выявления в обеих группах имеет антиген HLA-B35. Антиген HLA-B18 выявлен только в группе ХДЗП. Антиген HLA-B40 только в группе гемобластозов плюс HBV-инфекция. В результате анализа установлено, что антигены HLA-B35, В40 маркируют риск возникновения HBV-инфекции у больных гемобластозами. Для более глубокого анализа данного утверждения и выявления клинико-диагностических критериев вирусного гепатита В у больных гемобластозами, мы провели сравнительный анализ распределения антигенов HLA у данных больных с ХВГ и больных, имеющих только HBsAb.

На фиг. 3 показано, наибольшие различия выявлены по антигенам HLA-B35, В40: имеется достоверно значимое повышение частоты регистрации данных антигенов в группе больных гемобластозами плюс хронический вирусный гепатит В и отсутствие достоверного различия в группе больные гемобластозами, перенесшие вирусный гепатит В. Имеется достоверное повышение частоты регистрации антигена HLA-A28, B22 у больных гемобластозами с хроническим гепатитом В и нет достоверного повышения процента обнаружения данного антигена у больных, перенесших вирусный гепатит В. Таким образом нами обнаружено, что ХГВ у больных гемобластозами развивается при наличии антигенов HLA-A28, В22, В35, В40.

Для выявления более тонких различий между группами исследуемых больных были проанализированы различия по гаплотипам HLA.

Из таблицы следует, что резистентность к HBV-инфекции у больных гемобластозами маркируется гаплотипом А2/В27(частота гаплотипа Н=84,7).

Ниже приводятся результаты апробации.

Пример 1.

Больной Г. истории болезни 1421. Поступил в отделение 30.01.97 с жалобами на слабость, недомогание, лихорадку, боли в костях, тяжесть в правом подреберье. При обследовании выявлена анемия, требующая уточнения. Было проведено типирование антигенов системы HLA I класса локусов А, В, С с помощью лимфоцитотоксичесской реакции, предложенной в 1964 году Терасаки.

Реакция основывается на двухэтапном воздействии на лимфоциты периферической крови: 1 - иммунной сыворотки, содержащей антитела известной специфичности; 2 - комплемента. Для выявления антигенов HLA были использованы наборы сывороток антилейкоцитарных гистотипирующих к антигенам I класса (панели N 36 и N 37 для локусов А,В,С) и комплемент кроличий лиофилизированный. Реакция проводилась с помощью специального микрооборудования: микрошприцев Гамильтона объемом 25 микролитров с механическим дозатором; планшет Терасаки для иммунологических реакций; пластиковых пробирок объемом 1 и 2 миллилитра. Для проведения реакции предварительно проводилось раскапывание под вазелиновое масло в лунки планшет Терасаки по 5 микролитров антисывороток. Подготовленные таким образом планшеты замораживали и хранили до момента использования в морозильной камере при температуре -20^oС. Непосредственно перед постановкой реакции сыворотки размораживали при комнатной температуре. В ходе реакции использовались раствор верографин - фикола и краситель - 5% раствор эозина. Верографин - фиколовый градиент приготавливали следующим образом: смешивали 9% водный (на дистиллированной воде) раствор фикола, молекулярная масса 400000 и 32,8% водный раствор верографина (верографин 60%) в соотношении 10:24. Полученный верографин-фиколовый раствор должен был иметь плотность 1,076-1,077. Краситель - 5% раствор эозина в дистиллированной воде смешивали перед использованием в соотношении 4:1 с 4,26% гипертоническим раствором хлористого натрия.

Реакция может быть выполнена несколькими методами, из которых был применен наиболее используемый - "двухступенчатый метод", предложенный Национальным институтом здоровья в Бетезде (NIH-метод).

Выделение лимфоцитов: венозную кровь объемом 5-6 мл дефибринировали в контейнере с плоским дном, содержащим стеклянные бусинки d-6 мм равномерным встряхиванием в течение 10-15 минут; в центрифужную пробирку помещали 2 мл раствора верографин-фикола; 4 мл дефибринированной крови, смешанной в равных количествах с физиологическим раствором, осторожно наслаивали на раствор верографин-фикола; центрифугировали 20 минут при 1500 об/мин; образовавшееся "облачко" лимфоцитов (белое кольцо между градиентом плотности и надосадочной жидкостью) переносили в чистую пробирку; добавляли к взвеси лимфоцитов 5 мл раствора Хенкса и центрифугировали при 1500 об/мин в течение 10 минут для отмывания от смеси верографин-фикола; отмывание повторяли дважды; удалив надосадочную жидкость концентрацию взвеси лимфоцитов доводили до 2-4•10³ в 1 мкл с помощью раствора Хенкса. Постановка реакции: пробирку с лимфоцитарной взвесью встряхивали; с помощью микрошприца Гамильтона вносили по 1 мкл взвеси лимфоцитов взвесь в лунки планшет Терасаки, содержащие гистиотипирующие сыворотки (размороженные непосредственно перед проведением реакции); инкубировали при комнатной температуре в течение 45 минут; добавляли в каждую лунку по 4-5 мкл стандартного кроличьего комплемента; инкубировали в темном месте при комнатной температуре в течение 1 часа; планшеты резко встряхивали для удаления вазелинового масла; добавляли в каждую лунку по 1 мкл 5% раствора эозина; через 6-7 минут планшеты встряхивали для удаления избытка красителя; проводили оценку результатов с использованием микроскопа Биолам при увеличении 10•20.

Оценка реакции проводилась по соотношению токсированных (прокрашенных) и нетоксированных (блестящих) лимфоцитов в поле зрения микроскопа. Если лимфоциты, несущие определенный HLA-антиген, "распознаются" сывороткой, то происходит реакция клеточного лизиса, которая определяется по проникновению красителя в клетки. Интенсивность реакции оценивалась по следующим критериям: 100%-90% гибель клеток - резко положительная(++++); 75%-50% гибель клеток - положительная (+++); 50%-25% гибель клеток - слабо положительна (++); 25%-10% гибель клеток - результат сомнительный (-+). Отрицательным конролем служили результаты реакции взаимодействия лимфоцитов с нетоксической сывороткой лиц IV группы крови, не содержащей анти-HLA антитела, положительным - результаты реакции с антилимфоцитарной сывороткой.

При оценке результатов учитывался принцип "батарейности". Использование нескольких иммунных сывороток разных серий повышает точность полученных результатов и уменьшает вероятность ошибки.

В результате у больного был определен антигенный профиль HLA-A3A9B12B35. Наличие антигена HLA-B35 позволило прогнозировать у больного гемобластоз и хронический гепатит В. В дальнейшем на основании исследования костного мозга, анализов крови и цитохимических реакций больному был выставлен диагноз острого лимфобластного лейкоза. Было назначено лечение по протоколу Хельцера (1994 г.). Проведено комплексное исследование на выявление признаков поражения печени (исследование маркеров вируса гепатита В методом ИФА в сыворотке крови, биохимическое исследование крови, УЗИ). Признаков поражения печени выявить не удалось. В течение курсовой полихимиотерапии больной получил более 30 гемотрансфузий. При повторном исследовании сыворотки крови на протяжении 6 месяцев у больного выявлен HBsAg, HBcAb, ABeAb, увеличение уровня трансаминаз в 2 раза, уровень билирубина в пределах нормы, УЗИ-печени определило диффузное уплотнение паренхимы печени. При расспросе больной предъявлял прежние жалобы. Перечисленные клинико-лабораторные синдромы послужили основанием для диагностики хронического гепатита В.

Таким образом, иммуногенетическое исследование позволило прогнозировать гемобластоз и хронический гепатит В при наличии антигена HLA-B35.

Пример 2.Больной Б. истории болезни 854. Поступил в отделение 20.01.97. Наблюдается с 1988 года с диагнозом хронический лимфолейкоз. Специфическое лечение получает 2-3 раза в год. За весь период лечения получил более 50 гемотрансфузий. При включении больного в группу обследования предъявлял жалобы на слабость, боли в костях, суставах, периодически тяжесть в правом подреберье, в эпигастрии. Из анамнеза: год назад перенес острый вирусный гепатит В (с характерной клиникой, желтухой, повышением уровня трансаминаз в 5 раз, повышения уровня билирубина в 2 раза, в сыворотке крови регистрировался HBsAg). При иммуногенетическом исследовании (описание методики - пример 1) у больного определен антигенный профиль HLA-A1A9B15B40, что позволило прогнозировать у больного вероятность хронизации гепатита В.

При обследовании: повышение уровня трансаминаз в 1,5 раз, уровень билирубина не изменен. Определены маркеры вируса гепатита В методом ИФА: HBsAg, НВсАb, НВеА. УЗИ печени: паренхима печени диффузно уплотнена. Наблюдение за больным в течение последующих 6 месяцев, с неоднократным контролем маркеров вирусного гепатита В позволило установить диагноз хронического вирусного гепатита В. Таким образом, иммуногенетическое исследование позволило прогнозировать хронизацию гепатита В при наличии антигена HLA-B40.

Пример 3. Больной Т. истории болезни 5676. Поступил в отделение 18.04.97. Наблюдается в гематологическом отделении в течение 2 лет с диагнозом множественная миелома. За период лечения получил более 50 гемотрансфузий и 6 курсов полихимиотерапии. Проведено комплексное исследование на выявление признаков поражения печени (исследование маркеров вируса гепатита В методом ИФА в сыворотке крови, биохимическое исследование крови, УЗИ). Признаков поражения печени выявить не удалось. При иммуногенетическом исследовании (описание методики - пример 1) у больного определен антигенный профиль HLA-A2A19B12B27 (имеется гаплотип А2/В27), что позволило прогнозировать у больного резистентность к заражению вирусом гепатита В. При наблюдении за больным в течение 1 года с неоднократным контролем маркеров вируса гепатита В, факта заражения вирусом гепатита В не обнаружено. Таким образом, иммуногенетическое исследование способствовало прогнозированию резистентности к заражению вирусом гепатита В больного при наличии множества факторов риска (состояние иммуносупрессии, большое количество гемотрансфузий, массивная медикаментозная нагрузка).

Предлагаемым способом достигнуто повышение точности прогнозирования особенностей течения хронического вирусного гепатита В у больных гемобластозами.

Достоинствами способа является его высокая достоверность, простота лабораторного выполнения, что указывает на возможность широкого применения в гастроэнтерологических, гематологических стационарах, онкологических клиниках.

Изобретение относится к области медицины, в частности к гастроэнтерологии и гематологии. Способ обеспечивает повышение точности прогнозирования особенностей течения хронического гепатита В у больных гемобластозами. Проводят иммуногенетическое исследование, при этом в венозной крови определяют антигены локусов А, В, С системы HLA и при наличии антигена HLA-B35 прогнозируют хронический гепатит В и гемобластоз, при наличии антигена HLA-B40 прогнозируют хронизацию гепатита В, при наличии гаплотипа А2/В27 прогнозируют резистентность к инфицированию вирусом гепатита В. 3 ил., 1 табл.

Способ прогнозирования особенностей течения хронического гепатита В у больных гемобластозами путем иммуногенетического исследования, отличающийся тем, что в венозной крови определяют антигены локусов А, В, С системы HLA и при наличии антигена HLA-B35 прогнозируют хронический гепатит В и гемобластоз, при наличии антигена HLA-B40 прогнозируют хронизацию гепатита В, при наличии гаплотипа А2/В27 прогнозируют резистентность к инфицированию вирусом гепатита В.