СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ ОПУХОЛЕЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ АНТИСЫВОРОТКИ К УНИВЕРСАЛЬНОМУ ОПУХОЛЕВОМУ АНТИГЕНУ Российский патент 1999 года по МПК G01N33/53 G01N33/96 

Изобретение относится к медицине, более точно к онкологии, и может быть использовано в диагностике злокачественных опухолей.

Известные аналогичные способы диагностики опухолей имеют недостаточно высокую чувствительность и даже у наиболее эффективных из них она не превышает 40-60%. Такая низкая чувствительность известных онкологических иммунодиагностических тестов объясняется тем, что используемые в этих реакциях онкомаркеры, строго говоря, таковыми не являются и представляют собой органоспецифические или онкофетальные антигены, присущие в норме отдельным организмам или системам органов. Это приводит к тому, что ожидаемое универсальное иммунологическое выражение особенностей единого механизма опухолеобразования подменяется частным, присущим не опухолевым состояниям (воспаление, коллагенозы).

Известно, что органоспецифические антигены не являются обязательными для опухолевой трансформации клеток, что и дает такой высокий процент ложноположительных результатов при диагностике злокачественных опухолей.

Краткий обзор иммунодиагностики в онкологии показывает следующее.

В 1949 г. Л.А.Зильбер впервые показал, а в 1957 г.Т.Прэн и Дж.Мэйн подтвердили, что клеткам злокачественных опухолей присущи собственные антигены.

Принято выделять 4 группы антигенов (по Абелеву).

1) антигены вирусных опухолей (идентичны для любых вирусных опухолей этого вида);
2) антигены канцерогенных опухолей (строго индивидуальны как для больных, так и для опухоли);
3) изоантигены трансплантационного типа или ТСТА - опухолеспецифические трансплантационные антигены различны во всех индивидуальных опухолях, индуцированных химическими антигенами и тождественны в разных опухолях, вызванных одним вирусом;
4) эмбриональные антигены.

В процессе канцерогенеза клетки подвергаются дедиференцировке, приобретая эмбриональный тип строения. В них часто обнаруживают эмбриональные антигены, специфичные для эмбриональных стадий развития организма. Эти антигены способны иммунизировать организм против опухоли. Наиболее изучены антигены: α- фетопротеин и раковоэмбриональный антиген (РЭА). I-й обнаруживают при первичной карциномии печени, II - при аденокарциноме кишечника, желудка, пищевода или поджелудочной железы.

У детей с нейробластомой, лимфосаркомой или опухолями мозга обнаруживается α₂-фетопротеин, при раке желудка- фетальный сульфогликопротеин. Эти антигены локализованы в клеточных мембранах или циркулируют в крови.

Существует специфическая группа антигенов, так называемые гетероспецифические антигены. Их нельзя отнести к чужеродным для данного организма, так как помимо опухоли они присутствуют в других нормальных тканях. К числу их относится почечный антиген, который присутствует в норме в почке и в опухоли печени-гепатоме.

Аденокарцинома почки содержит антиген легких и печени.

Иммунодиагностика злокачественных опухолей основана на индикации в крови больных вышеперечисленных антигенов, антител к ним и выявлении сенсибилизированных к опухолевым антигенам лимфоцитов.

На обнаружении α- фетопротеина основаны методы диагностики лимфосаркомы, нейробластомы (см. На обнаружении антител к РЭА -способ по патенту РФ N2077725, кл.С 01 N 33/53, к вирусу лейкоза - способ по авторскому свидетельству N 1641443, G 01 N 33/53).

На обнаружении гетерогенных антигенов патент РФ N2063768, 1991 г., А 61 K 39/00, патент РФ N 2025734, МПК G 01 N 33/53, авт.свид. СССР N1589215, G 01 N 33/53, авт. свид. N 1704087, G 01 N 33/53, авт.свид.N 170922, авт.свид. N 1589215.

В авт. свид. N1805392 (G 01 N 33/53) описан способ диагностики рака по антигенам (H_LA-B35) лимфоцитов.

Однако существующий уровень диагностики таков, что, по сути дела, ни один из тестов не является универсальным. Обнаружение в крови антител является наименее достоверным тестом, т.к. у человека в крови существует очень широкий спектр противоопухолевых и тканевых антител. Не существует методов по выявлению специфического универсального антигена опухолей.

В этом плане перспективно выявление сенсибилизированных лимфоцитов, которые ингибируют рост колоний опухолевых клеток. Однако они активны только против "своего" вида опухоли.

Таким образом, используемые методы иммунодиагностики опухолей слабо удовлетворяют требованиям первичной диагностики опухолей, совершенно неудовлетворительны в целях скрининга злокачественных новообразований и групп повышенного риска и могут быть применены с известными ограничениями лишь в иммуномониторинге лечения злокачественных опухолей.

Предлагаемый метод обнаружения онкомаркера принципиально отличается от ныне используемых тем, что определяет универсальный, высоко специфический антигенный маркер опухолевого роста, сохраняющийся на всех этапах опухолевой прогрессии.

Метод основан на результатах общетеоретических и экспериментальных работ автора, в которых установлено, что в любых, гистологически различных клетках злокачественных опухолей функционирует устойчивый в опухолевой прогрессии процесс Т-клеточного иммунологического распознавания поверхностных эмбриоспецифических антигенов и что указанный механизм лежит в основе феноменов опухолеобразования (иммортализация и прогрессия).

Прототипом заявленного способа выбран способ по патенту РФ N2063768, 1991, МПК А 61 К 39/00, который включает извлечение тканей опухоли у умерших лиц, замораживание ее, диспергирование, декантирование клеток, экстрация антигена из надосадочной жидкости, иммунизация животных экстрактом, получение антисыворотки, постановка иммунологической реакции иммунодиффузии, по результатам которой выносят суждение о наличии или отсутствии опухоли, т.е. проводят диагностику.

Заявленный способ в отличие от известного позволяет получить антисыворотку к идиотопу Т-клеточного рецептора, функционирующего в клетках злокачественных опухолей, то есть антиидиотипической антиэмбриональной сыворотки, что обеспечивает диагностику всех видов опухолей независимо от их генеза и расположения.

Для осуществления способа необходимо выделить эмбрион в стадии Fetus у генетически однородных животных, диспергировать его. Клеточной взвесью провести иммунизацию животного той же генетической линии. Затем необходимо у иммунизированного животного извлечь клетки селезенки, выделить из них лимфоциты в градиенте плотности фиколл-верографина (1,065-1,079). Этими лимфоцитами следует провести многократную иммунизацию сингенных интактных животных и получить у них стандартным образом антисыворотку. Эту антисыворотку следует профильтровать через миллипоровые фильтры с диаметром пор 20 мкм и ввести фильтрат в иммунологическую реакцию с тканями обследуемого, а затем по реакции иммунофлуоресценции или СОЭ диагностировать опухоль. В качестве тканей могут быть использованы ткани опухолей в реакции иммунофлуоресценции или кровь больного в реакции СОЭ.

Диагноз опухоли устанавливают при статистически достоверных различиях результатов реакций между опытной и контрольной пробами.

При этом в случае проведения реакции СОЭ для вычисления различий между опытной и контрольной пробами используют следующую расчетную формулу

где α - - диагностический коэффициент, который при наличии опухоли составляет ≥ 1,5
A - величина СОЭ в опытной пробе (к цитратной крови обследуемого добавлена антисыворотка к антигену опухоли)
B₁ и В₂ - величина СОЭ в контрольных пробах (к цитратной крови обследуемого добавлена антисыворотка того же вида животного, который использовался для получения антисыворотки)
X - наибольшее значение СОЭ в анализе (или в пробе А или среднее B₁ и B₂, т. е.(B₁ + B₂)/2].

Пример осуществления способа.

У крыс линии Wistar весом 300-500 г извлечен эмбрион в стадии Fetus. Ткани его диспергированы в воде в соотношении объемов ткань: вода 1:5. Полученной взвесью осуществлялась еженедельная иммунизация интактных крыс линии Wistar. Через 1,5 месяца у забитых крыс извлечена селезенка, диспергирована и в градиенте фиколл- верографина 1,077 получены Т лимфоциты.

Из них приготовили взвесь 1:1, которую вводили еженедельно другим интактным крысам. После 5 иммунизаций крысы забиты, у них взята кровь, "осветлена", получена из нее сыворотка, профильтрована, с указанной сывороткой поставлена реакция СОЭ у нижеприведенных групп больных. При постановке реакции СОЭ использовали стандартный капилляр с внутренним диаметром 0,8 мм. К 200 мкл 5% забуференного раствора цитрата натрия добавляют 800 мкл цельной свежей венозной крови, взятой в момент проведения анализа, не позже, чем через 20 сек после забора. От момента смешивания крови с консервантом до проведения анализа не должно пройти более 1 часа. При наличии гемолиза или свертывания анализ ставить нельзя. Из этой крови берут 3 порции по 70 мкл каждая в 3 отдельные пробирки. В одну из них добавляют рабочую (с антителами) в 2 другие -контрольные (без антител) сыворотки по 20 мкл каждая. Сыворотки вводят непосредственно в кровь с консервантом, а не на стенки. Капилляры должны быть одного размера. Смеси перемешивают и заполняют ими капилляры до отметки 5/0. Выдерживают 1 час. Через 1 час снимают показатели и обсчитывают их по вышеприведенной математической формуле.

Указанным способом была получена на крысах линии Wistar антисыворотка, которая использовалась в диагностике заболеваний у конкретных больных.

В анализе с кровью больной К-овой, 1942 г. рождения, d-s: рак прямой кишки получены следующие результаты:
A=25, B₁=28, B₂=28
По математической формуле найден коэффициент α:

1/7 > 1,5, т.е. диагноз злокачественная опухоль подтверждается
В анализ крови больного с фибромой мочки уха получены следующие результаты:
D-s: рак прямой кишки получены следующие результаты:
A=10, B₁=12, B₂=12
По математической формуле найден коэффициент α:

α < 1/5, т.е. диагноз незлокачественная опухоль подтверждается,
Ниже даны результаты исследований на группе больных злокачественными опухолями.

Рак молочной железы - 125 больных, чувствительность - 83,2%;
Рак легкого - 247 больных, чувствительность - 98,1%;
Рак желудка - 156 больных, чувствительность - 85,2%;
Рак ободочной кишки - 23 больных, чувствительность - 82,5%;
Рак прямой кишки - 27 больных, чувствительность - 92,5%;
Рак щитовидной железы - 58 больных, чувствительность - 79,5%;
Рак почки - 38 больных, чувствительность - 78,6%;
Рак тела матки - 412 больных, чувствительность - 75,08%;
Рак шейки матки - 41 больной, чувствительность - 81,8%,
Контрольная группа -
Практически здоровые - 400 человек, чувствительность - 5,1%;
Кистозно-фиброзная мастопатия - 221 человек, чувствительность - 8,3%;
Гастрит - 120 человек, чувствительность - 6,2%;
Язвенная болезнь желудка - 62 человека, чувствительность - 8,3%;
Коллагенозы - 40 человек, чувствительность - 6,5%;
Воспаление легких - 60 человек, чувствительность - 7,2%; (остр. и хрон.)
Простатиты - 18 человек, чувствительность - 2,1%;
Хронические колиты - 115 человек, чувствительность - 4,2%.

Заключение: предлагаемый метод имеет чувствительность - 85,9% и специфичность - 92,4%, то есть является высокоэффективным диагностическим тестом.

Для диагностики опухоли в реакции иммунофлуоресценции использовали общие приемы присущие этим методам и широко известные в биологии (см. например. Добровольцев Г. Е. "Флуоресцентные зонды в исследовании клеток, мембран и липопротеинов" М.,1989 г.)

Способ может быть использован в медицине, а именно в онкологии. У генетически однородных животных выделяют эмбрион в стадии fetus. Готовят клеточную взвесь. После иммунизации у животного производят забор клеток селезенки, выделяют лимфоциты и проводят 2-й этап иммунизации животного той же генетической линии взвесью этих лимфоцитов. После чего получают антисыворотку, добавляют в нее клетки интактных органов тех же животных, смесь декантируют. Надосадочную жидкость фильтруют через миллипоровый фильтр с диаметром пор 20 мкм. Фильтрат добавляют к крови обследуемого, а результат учитывают по иммунофлуоресценции и СОЭ и при величинах, достоверно отличающихся от контрольных значений, диагностируют опухоль. Способ обеспечивает повышение чувствительности и специфичности диагностики. 1 з.п. ф-лы.

1. Способ диагностики злокачественных опухолей с использованием специфической антисыворотки к универсальному опухолевому антигену, включающий выделение тканей, приготовление клеточной взвеси, иммунизацию животных, забор крови иммунизированных животных, получение из нее антисыворотки, введение ее в реакцию с кровью обследуемого, по результатам которой диагностируют опухоль, отличающийся тем, что проводят 2-этапную иммунизацию, в качестве тканей на 1-м этапе у генетически однородных животных выделяют эмбрион на стадии fetus, готовят клеточную взвесь, после иммунизации которой у животного производят забор клеток селезенки, выделяют из них лимфоциты и проводят 2-й этап иммунизации животного той же генетической линии взвесью этих лимфоцитов, после чего у животного получают антисыворотку, добавляют в нее клетки интактных органов тех же животных, смесь декантируют, отделяют надосадочную фракцию, фильтруют ее через миллипоровый фильтр с диаметром пор 20 мкм, фильтрат добавляют к крови обследуемого, а результат учитывают по иммунофлуоресценции или в реакции СОЭ и при величинах, достоверно отличающихся от контрольных значений, диагностируют опухоль. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что реакции СОЭ рассчитывают по математической формуле

где α - диагностический коэффициент, который при наличии опухоли составляет 1,5;
A - величина СОЭ в опытной пробе (к цитратной крови обследуемого добавлена антисыворотка к антигену опухоли);
B₁ и B₂ - величина СОЭ в контрольных пробах (к цитратной крови обследуемого добавлена антисыворотка того же вида животного, который использовался для получения антисыворотки);
X - наибольшее значение СОЭ в анализе (или в пробе A, или среднее B₁ и B₂, т.е. (B₁ + B₂) / 2).