Штамм бактерий BacILLUS SUвтILIS - продуцент L - фенилаланина Советский патент 1991 года по МПК C12P13/22 C12N15/01 

1

(21)4716354/13 (22)06.07.89 (46)23.11.91. Бюл. №43 (71)Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов (72) Т. А. Ямпольская, Г. А. Великжанина. Н. И. Жданова, Т. А. Бачина, Н. А. Васильева и А. К. Соколов (53)663.15(088.8)

(56)Патент США

№4591562. кл. С 12 Р 13/22, 1986. Авторское свидетельство СССР № 1380212/кл. С 12 Р 13/22, 1986. (54) ШТАММ Б-АКТЕРИЙ BACILLUS SUBTILIS - ПРОДУЦЁНТГ-ФЕНИЛАЛАНИ- НА

(57)Изобретение относится к биотехнологии и касается нового штамма - незаменимой аминокислоты L-фенилаланина, которая применяется в медицине, а также может служить исходным веществом при синтезе аспартама - пептида, используемого в качестве интенсивного подсластителя пищевых продуктов. Целью изобретения является получение штамма бактерий Bacillus subtills ВКПМ-4761 (264-Т), способного синтезировать до 17 г/л L-фенилаланина при росте на простых по составу средах. При выращивании на среде с кукурузным экстрактом, аммонийным азотом, минеральными солями и при поддержании в среде концентрации сахара на уровне, близком к лимитирующему, после80 ч в культуральной жидкости накапливается 17 г/л L-фенилаланина. Коэффициент конверсии сахара в фе- нилаланин 12,2%.

со

с

Изобретение относится к биотехнологии и касается нового штамма - продуцента незаменимой аминокислоты L-фенилаланина, которая применяется в медицине, а также может служить исходным веществом при синтезе аспартама - пептида, используемого в качестве интенсивного подсластителя пищевых продуктов.

Целью изобретения является получение штамма бактерий Bacillus subtills ВКПМ В- 4761 (264-Т), способного синтезировать до 17 г/л L-фенилаланина при росте на простых по составу средах.

Штамм получен как мутант штамма В. subtills ВНИИгенетика-19п путем мутаге- низации клеток нитрозогуанидином и отбора мутантов, ауксотрофных по тирозину.

Штамм хранят в столбиках полужидкого агара Хоттингера (0,7%) с 2-5% мальтозы под слоем вазелинового масла при 2-4°С или в лиофильно-высушенном состоянии в стеклянных запаянных ампулах при комнатной температуре.

Штамм имеет следующую характеристику.

Культу рал ьно-морфологические признаки. Грамположительные спорообразую- щие палочки размером (2,5-4,5)хО,7 мкм. Размер спор (1,0-1,2) х (0,6-0,7) мкм.

Мясолептонный агар и агар Хоттингера: колонии после 24 ч инкубации при 37°С достигают 4-6 мм в диаметре, сплошные, круг- лые, с изрезанным краем, поверхность гладкая, цвет кремовый.

С

ю

CJ

о ел о

Агаризованная среда Спицайзена с 40 мкг/мл тирозина и 10 мкг/мл аденина: колонии после 48 ч инкубации при 37°С имеют 1 мм в диаметре, поверхность гладкая, блестящая, цвет серовато-белый,

Физиолого-биохимические признаки. Отношение к источникам углерода: использует сахарозу, глюкозу, мальтозу, маннит, глицерин, ацетат.

Отношение к источникам азота: использует мочевину, соли аммония.

Не растет на молоке, желатину разжижает слабо, хорошо растет на крахмале.

Отношение к аналогам аминокислот: устойчив к р-фторфенилаланину (9 мг/мл) и D-тирозину (0,075 мг/мл).

Потребность в факторах роста: требует для роста 40 мкг/мл тирозина, рост стимулируется аденином.

Ауксотрофность по тирозину позволяет штамму расходовать весь пул префено- вой кислоты (общего предшественника фенилаланина и тирозина) на синтез одного фенилаланина. Кроме того, З-дезокси-D- арабиногептулозонат-7-фосфат синтетаза (ДАГФ-с), ключевой фермент биосинтеза ароматических аминокислот, у исходного штамма репрессируется в присутствии тирозина и фенилаланина. Отсутствие тирозина в пуле предлагаемого штамма приводит к снижению репрессии ДАГФ-с, что обеспечивает этому штамму более высокий, чем у исходного штамма, уровень образования фенилаланина (до 17г/л).

Другим преимуществом предлагаемого штамма по сравнению с известным является полное отсутствие в культуральной жидкости тирозина, что значительно облегчает процесс выделения целевого продукта. В то же время потребность в тирозине обеспечивается присутствием в ферментационной среде кукурузного экстракта, который добавляется в среду и для известного штамма. Штамм растет при 28-3°С: оптимальная температура 32°С. Рост возможен при рН 5-9, оптимум рН 7,0-7,2.

Получение L-фенилаланина с использованием предлагаемого штамма-продуцента осуществляют следующим образом.

Клетки штамма Вас. subtills ВКПМ В- 4761 выращивают в течение 1 сут на агари- зованной среде Хоттингера, пересевают в колбы со стерильной питательной средой, содержащей источники углерода, азот, ростовых веществ и необходимые минеральные соли, и культивируют в течение 18-24 ч на качалке при 220 об/мин и 28-37°С. Полученный посевной материал вносят в колбы или ферментеры со стерильной питательной средой, содержащей источники углерода

азота, ростовых веществ и минеральные соли. В качестве источника углерода используют сахарозу или содержащие ее субстраты, например технологический сахар, в качестве источника азота - мочевину или соли аммония, в качестве ростовых веществ - кукурузный экстракт. Ферментацию осуществляют в течение 46-72 ч в условиях аэрации при 28-37°С, рН 6-8, в колбах на качалке

0 или в ферментере. В конце ферментации в культуральной жидкости накапливается до 17 г/л фенилаланина.

Препарат L-фенилаланина из ферментационного раствора готовят в виде кор5 мового препарата или выделяют в кристаллической форме известными способами.

Пример 1 Штамм Вас. subtilis ВКПМ В-4761 выращивают в течение 18ч при 37°С

0 на агаризованной среде Хоттингера. Затем петлей засевают колбы объемом 250 мл, содержащие 30 мл посевной среды. Состав посевной среды, г/л: сахароза 50; кукурузный экстракт 20: К2НР04 1,4; KH2PO-J 0,6;

5 водопроводная вода до 1 л. рН до стерилизации 7,2-7,5, после стерилизации 7,0-7.2. Посевную среду стерилизуют в автоклаве при 0,8 атм в течение 30 мин. После посева колбы устанавливают на круговую качалку

0 (220 об/мин) и инкубируют при 30°С в течение 18ч. Готовый посевной материал вносят в количестве 5 об% в колбы емкостью 750 мл с 30 мл ферментационной среды. Состав ферментационной среды, г/л: сахароза 130;

5 кукурузный экстракт 30; КНР04 1,4; КН2Р04 0,6; NaCI 0,5; MgSO 1.0; мочевина 5,0; водопроводная 1 л. рН среды 7,2. Мочевину добавляют пгеред засевом в готовую среду в виде 40%-ного раствора, простери0 лизованного при 0,5 атм в течение 30 мин. После засева колбы устанавливают на качалку. После 72 ч роста при 30°С в культуральной жидкости накапливается 12 г/л фенилаланина,

5 Помимо фенилаланина в культуральной жидкости содержатся следующие аминокислоты, г/л: 0,56; аспарагин 0,042; треонин 0,0088; серии 0,215; глутаминовая кислота 0,119; аланин 0,098; изолейцин 0,056: лей0 цин 0,171; гистидин 0,164; лизин 0,116. Ароматические аминокислоты тирозин и триптофан в культуральной жидкости отсутствуют.

Исходный штамм В. subtilis ВНИИгене5 тика-19п в аналогичных условиях образует 9,1 г/л L-фенилаланина.

П ри м е р 2. Посевной материал штамма ВКПМ В-4761 выращивают, как в примере 1. Готовым посевным материалом (50 мл) засевают 650 мл ферментационной среды.

Состав среды, г/л: кукурузный экстракт 30; NaCI 0.5; ( 5; MgSCM 1; КН2Р04 0,6; КН2Р04 1-4; водопроводная вода до 1 л. Культивирование ведут при 32°С в лабораторном ферменте, оснащенном системой автоматического рН-статирования и перистальтическим насосом для подачи в ферментер стерильного раствора сахара, при расходе продуваемого через культуральную жидкость воздуха 600 мл/мин и скорости вращения мешалки 750 об/мин. Значение рН культуральной жидкости поддерживают на уровне 7,0-8,1, используя 6,9 н. раствор аммиачной воды. Концентрацию сахара в процессе культивирования поддерживают на уровне, близком к лимитирующему. Для этого через 1 ч после засева в ферментер начинают подавать раствор сахара концентрации 700 г/л, вначале со скоростью 1 мл/ч, затем после 15 и 21 ч культивирования скорость подачи увеличивают до 2.0 и 2.5 мл/ч соответственно и далее не меняют. При таком режиме подачи концентрация сахара в среде на протяжении процесса ферментации не выходит за пределы 0-5 г/л. Культивирование ведут в течение 80 ч. В результате в культуральной жидкости накапливается 17 г/л фенилаланина. коэффициент конверсии 12,2%. Штамм-прототип в аналогичных условиях выделяет 9,5 г/л фе- нилаланина, коэффициент конверсии 7%.

Пример 3. Условия выращивания посевного материала, начальный состав ферментационной среды и условия ферментации, как в примере 2. Отличие в том, что ферментационная среда содержит 15 г/л

(NH4)2SO4 вместо сахара в ферментер подают раствор мелассы с концентрацией углеводов 450 г/л. Скорость подачи составляет 1,7 мл/ч, после 15 культивирования скорость подачи увеличивают до 3,5 мл/ч и далее не меняют. Культивирование ведут при 32°С в течение 80 ч. По окончании процесса в культуральной жидкости накапливается до 12 г/л L-фенилаланина. Коэффициент конверсии углеводов мелассы в фенилаланин составляет 8,2%.

Пример 4. Ферментацию проводят в аппарате объемом 10 м3. Состав ферментационной среды, как в примере 2. Начальный объем среды 5 м3. Посевной материал, выращенный в колбах, как описано в примере 1, вносят в количестве 1 л. Ферментацию ведут при 32-33°С, перемешивании 260 об/мин и продувании воздухом 5 м /мин. рН поддерживают на уровне 7 автоматической подачи 20%-ного водного раствора аммиака. После 12 ч ферментации в аппарат начинают подавать стерильный раствор сахара с концентрацией 550 г/л. Вначале скорость подачи составляет 8 л/ч, через 10 ч ее увеличивают до 23 л/ч и далее не меняют. Общее количество поданной подпитки составляет 1300 л (720 кг сахара). После 75 ч ферментации содержание фенилаланина в культуральной жидкости составляет 13 г/л. Коэффициент конверсии сахара в фенилаланин 10,8%.

Ф ормула изобретения Штамм бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-4761 - продуцент L-фенилаланина.