ФРАГМЕНТ ДНК PCG 12, КОДИРУЮЩИЙ СИНТЕЗ β-ГАЛАКТОЗИДАЗЫ PENICILLIUM CANESCENS, И ШТАММ ГРИБОВ PENICILLIUM CANESCENS - ПРОДУЦЕНТ b-ГАЛАКТОЗИДАЗЫ Российский патент 1997 года по МПК C12N9/38 C12N15/56 C12N15/80 C12N1/14 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и, в частности, генетической инженерии и представляет собой фрагмент ДНК мицелиального гриба Penicillium canescens, кодирующий синтез секретируемой β-галактозидазы, и штамм Penicillium canescens продуцент b-галактозидазы, сконструированный методами генетической инженерии на основе этого фрагмента. Фермент b-галактозидаза используется в пищевой промышленности для гидролиза лактозы, превращая ее в две молекулы моносахаридов глюкозу и галактозу.

В качестве продуцентов b-галактозидазы известны различные виды бактерий, дрожжей, актиномицетов и мицелиальных грибов. Грибные секретируемые b-галактозидазы, проявляющие свою активность при кислых значениях pH среды, используются в молочной промышленности для гидролиза лактозы в молочной творожной сыворотке.

Известны грибные штаммы-продуценты различной видовой принадлежности: Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Alternaris tenuis, Penicillum multicolor, Penicillium canescens. Наибольшей активностью среди известных продуцентов обладают Penicillium multicolor и Penicillium canescens. Продуцент Penicillium multicolor KU-0-132 (FERM-P4375, АТСС 20539) за 72 ч глубинной ферментации образовывает 140 ед/мл b-галактозидазы в культуральной жидкости, измеренной по гидролизу О-нитрофенил-b-D-галактозида (ОНФГ) при 37^oC. Штамм Penicillium multicolor KU-0-132 растет на среде с мукой из семян хлопчатника и рисовыми отрубями, т.е. на дорогих и малодоступных субстратах, что является недостатком для его использования. Штамм Penicillium canescens 20171 (ВКПМ F178) (Авт. свид. СССР N 1065476A) за 96 ч глубинного культивирования образовывает 42-70 ед/мл b-галактозидазы (субстрат ОНФГ, 30^oC). Наиболее близким аналогом к предлагаемому (прототипом) является штамм Penicillium canescens ДГ-86/18 (ВКПМ F-436) (Авт. свид. СССР N 1738854A1), который за 120-144 часа накапливает b-галактозидазу до 100-130 ед/мл культуральной жидкости (субстрат ОНФГ, 30^oC). Недостатками штамма Penicillium canescens ДГ-86/18 являются низкий уровень накопления b-галактозидазы и длительное время ферментации, что в условиях возрастающей стоимости энергоресурсов делает его использование мало перспективным. До настоящего времени неизвестны штаммы-продуценты b-галактозидазы, полученные генно-инженерными методами.

Задача изобретения повысить уровень накопления b-галактозидазы Penicillium canescens в культуральной жидкости и сократить время ферментации.

Задача достигается получением фрагмента ДНК PCG12, несущего ген секретируемой b-галактозидазы и конструированием на его основе с помощью методов генетической инженерии штамма Penicillium canescens PCG12-38, содержащего несколько копий гена секретируемой b-галактозидазы. Этот штамм за 96 ч ферментации на среде со свекловичным жомом и БВК накапливает b-галактозидазу до 190-220 ед/мл культуральной жидкости (субстрат ОНФГ, 30^oC).

Конструирование штамма состояло из нескольких этапов: Этап 1 выделение из природного изолята- штамма Penicillium canescens 20171 (ВКПМ F178), фрагмента ДНК PCG12, кодирующего ген секретируемой b-галактозидазы;
Этап 2 включение фрагмента ДНК PCG12 с геном b-галактозидазы в состав векторной молекулы pTZ19R;
Этап 3 получение путем многоступенчатой селекции с применением мутагенных факторов и отбора на селективных средах штамма-реципиента Penicillium canescens PCA10, неспособного к росту на неорганических источниках азота вследствие мутации в гене нитратредуктазы;
Этап 4 трансформация штамма-реципиента PCA10 векторной молекулой с включенным геном b-галактозидазы и плазмидой с гетерологичным геном нитратредуктазы из Aspergillus niger;
Этап 5 отбор наиболее продуктивного трансформанта, его генотипический, фенотипический и физиолого-биохимический анализ.

Новый штамм Penicillium canescens PCG12-38 депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ F715.

По сравнению с известными грибными продуцентами Penicillium canescens PCG12-38 характеризуется более высоким уровнем накопления b-галактозидазы и более коротким временем ферментации. Отличия предлагаемых технических решений заключаются в том, что наблюдаемый эффект достигается за счет введения в геном гриба Penicillium canescens 20171 (ВКПМ F178) дополнительных копий впервые клонированного нами гена секретируемой b-галактозидазы.

Штамм Penicillium canescens PCG12-38 обладает следующими культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками.

Морфологические признаки на различных питательных средах после 10 сут роста при 30^oC:
Сусло-агар. Диаметр колоний 6,5-7,5 см. Колонии различной степени пушистости, состоящие из более плотного базального мицелия и более рыхлого воздушного мицелия. Колонии радиальнобороздчатые, с обильным спороношением, дымчатозеленовато-серые с растущим краем (2-4 мм). Обратная сторона оранжево-темно-коричневая. Конидиеносцы 430-450 х 3.0-3.2 мкм отходят от войлочного мицелия, четко-шероховатые. Конидии 2.0-2.2 мкм шаровидные, в молодом возрасте гладкие, в старом шероховатые, образуются в цепочках, соединяются в колонки, со временем распадающиеся.

Агаризованная среда Ролена-Тома с сахарозой. Диаметр колоний 38-48 мм. Колонии войлочные или слабопушистые в центре, слабовыпуклые, с радиальными бороздками, белого цвета, по краям окрашены в серо-голубоватый тон, края неровные, лопастные, обратная сторона серо-бежевого тона.

Та же среда, но с добавлением кукурузного экстракта. Диаметр колоний 5.8-6,5 см. Колонии светло-серые, бархатистые, по краю слабопушистые. Край ровный, ширина зоны роста 2-7 мм. Радиальнобороздчатые, слабовыпуклые. Конидиеобразование скудное. Обратная сторона колоний темно-коричневая.

Агаризованная среда Чапека с глюкозой. Диаметр колоний 2,8-4,0 см. Колонии серые, слегка вогнутые, складчатые, с ровным выпуклым краем. Конидиеобразование интенсивное, цвет конидий светло-серый. Обратная сторона колоний с радиальными складками слабо-кремового тона.

Та же среда, но с добавлением кукурузного экстракта. Диаметр колоний 5,5-6,0 см. Колонии светло-серые, радиальнобороздчатые, слабовыпуклые, с широким растущим краем, слабопушистым. Колонии бархатистые, обратная сторона радиальноскладчатая, коричневого оттенка. Конидиеобразование умеренное.

Физиолого-биохимические признаки.

Мезофил, растет при 25-37^oC,оптимальная температура роста 29^oC. Оптимум роста при значениях pH среды 4,1-5,8. Желатину разжижает слабо.

Отношение к источникам углерода. Хорошо усваивает моно-, ди- и полисахариды, за исключением арабинозы, которую утилизирует слабо. При росте на глюкозе, фруктозе, сахарозе, мальтозе, маннозе, глицерине образует ярко-желтый или коричневый пигмент.

Отношение к источникам азота. Хорошо усваивает аммонийный и нитратный азот, пептон, мочевину.

У заявляемого штамма Pinecillium canescens PCG12-38 избирательно увеличена активность секретируемой b-галактозидазы, доля которой составляет 70% от суммарного внеклеточного белка.

Генотипические признаки. Основной генотипический признак заявляемого штамма заключается в увеличенном числе (3-4 копии) генов секретируемой b-галактозидазы, тандемно интегрированных в составе рекомбинантной плазмиды pPCG12 в геном гриба Penicillium canescens PCA10 в результате гомологичной рекомбинации. Кроме того, штамм Penicillium canescens PCG12-38 дополнительно содержит плазмиду pSTA10 с геном нитратредуктазы Aspergillus niger (Unkles et al. 1989). При пересевах конидий утраты селективного маркера (плазмиды pSTA10) и значительного снижения активности b-галактозидазы не наблюдается, что свидетельствует о стабильности плазмид.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами:
Пример 1. Получение фрагмента ДНК PCG12, кодирующего синтез b-галактозидазы, из фаговой библиотеки генов мицелиального гриба. Penicillium canescens 20171 (ВКПМ F178).

Для получения банка генов ДНК гриба Penicillium canescens 20171 (ВКПМ F178) обрабатывают рестриктазой Sau 3a в условиях неполного расщепления, фракционируют при центрифугировании в градиенте плотности сахарозы, выделяя рестрикты размером 20 тыс. пар оснований (п.о.), и включают путем лигирования с ДНК-лигазой в ДНК фагового вектора lEMBL4. Далее готовят упаковочную смесь (белки фаговых головок и белки хвостов по отдельности), проводят упаковку в оптимальных соотношениях компонентов смеси и полученные фаговые частицы с рекомбинатными ДНК рассеивают на чашки Петри с питательной средой и индикаторными бактериями. Полученные негативные колонии (независимые клоны) в количестве 3•10⁴ в совокупности представляют собой банк генов Penicillium canescens. Далее из этого банка генов выделяют фрагмент ДНК PCG12, кодирующий ген секретируемой β-галактозидазы.

Для решения этой задачи синтезируют олигонуклеотидный зонд 1 с нуклеотидной последовательностью 5′TCAG

TCCCAIGTIACAGTATCCCTCTG 3′, который комплементарен участку, кодирующему с 4-й по 11-й аминокислотный остаток β-галактозидазы. Этот зонд в количестве 10 нг смешивают с 10 мкг мРНК, выделенной из гомогенизированных клеток мицелия гриба Penicillium canescens 20171 (ВКПМ F178), активно растущих на среде с свекловичным жомом и БВК, инкубируют 3 мин при 80^oC, а затем 1 ч при 50^oC и определяют нуклеотидную последовательность мРНК гена b-галактозидазы по направлению от праймера к 5'-концу. На основе этой последовательности РНК синтезируют олигонуклеотид 2 для гибридизационного скрининга фаговой библиотеки генов Penicillium canescens 20171 (ВКПМ F178): 5' GATGGTGAAGCCATCCAACTTATG 3'. Этот зонд радиоактивно метят до высокой специфической активности (1х10¹⁰ имп/мин мг) с помощью терминальной трансферазы в буфере, содержащем 100 мм какодилата К, pH 7,0, 1 мМ дитиотреитола, 100 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина, 100 нг зонда, 100 мкКи [α-^32p]dATP и 20 ед. фермента в течение 1 ч при 37^oC и добавляют в раствор для гибридизации (5х раствор Денхардта, 6х SSC, 0,5% SDS, 0,2 мг/мл ДНК спермы лосося) до конечной концентрации 10⁶ имп/мин мг. Фаговые бляшки переносят на нейлоновые фильтры и инкубируют в указанном растворе в течение ночи, плавно снижая температуру с 65^oC до комнатной, после чего отмывают фильтры от неспецифически связавшейся метки в растворе 4х SSC при 37^oC. Фильтры экспонируют с рентгеновской пленкой. При анализе геномной библиотеки гриба Penicillium canescens 20171 данным методом из 3•10⁴ рекомбинантных фагов выделено 22 клона, из которых был выбран клон PCG12, который несет фрагмент ДНК PCG12, кодирующий секретируемую β-галактозидазу, что было доказано следующим образом. При введении клонированного фрагмента ДНК PCG12 в геном гриба Aspergillus nidulans с помощью трансформации последний начинает секретировать b-галактозидазу, по признакам (молекулярная масса, иммуннологические тесты) неотличимую от фермента Penicillium canescens 20171. Анализ нуклеотидной последовательности ДНК фрагмента PCG12, определенной методом Сенгера с соавт. (Sanger et al. PNAS (1997), v.74, p.5463), показывает, что аминокислотная последовательность b-галактозидазы, установленная путем транслирования кодирующей рамки считывания совпадает с последовательностью аминокислот N-концевой части молекулы b-галактозидазы.

Далее получают плазмиду pPCG12, несущую фрагмент ДНК PCG12, кодирующий b-галактозидазу. 2 мкг ДНК клона PCG12, содержащего фрагмент ДНК PCG12 с геном b-галактозидазы, обрабатывают в течение 1 ч при 37^oC 20 ед. рестриктазы EcoRI и затем образовавшиеся фрагменты лигируют с 0,1 мкг плазмиды pTZ19R (Pharmacia catalog, 1986), предварительно расщепленную той же эндонуклеазой рестрикции. Лигирование проводят в течение ночи при 16^oC, добавляя в пробу 2 ед. ДНК-лигазы фага Т4. Клоны, содержащие фрагмент ДНК с данным геном, отбирают путем гибридизации с радиоактивно меченым зондом 2, после чего проверяют ориентацию вставки в полученной плазмиде pPCG12.

Пример 2. Получение штамма Penicillium canescens PCG12-38 с увеличенной активностью секретируемой b-галактозидазы.

Для решения этой задачи требуется система трансформации, позволяющая внедрять в геном штамма Penicillium canescens дополнительные копии гена b-галактозидазы. Штамм-реципиент Penicillium canescens PCA10, необходимый для трансформации, получен селекцией штамма Penicillium canescens F178 после мутагенеза нитрозогуанидином по признаку устойчивости к хлорату, что коррелирует с утратой активности нитратредуктазы. Полученный штамм Penicillium canescens PCA10 обладает способностью к росту на средах с органическими источниками азота, но неспособен утилизировать нитратный азот. Генетический дефект в полученном штамме затрагивает признак niaD, т.к. при трансформации штамма PCA10 плазмидой pSTA10, несущей ген с нитратредуктазой niaD Aspergillus niger (Unkles et al. Gene (1989), v.78, p.157), утраченный фенотип восстанавливается.

Штамм-реципиент PCA10 выращивают в течение 16ч при 30^oC на полной питательной среде следующего состава: пептон 3г/л, дрожжевой экстракт 2 г/л, KCl 0,52 г/л, KH₂PO₄ 1,52 г/л, и 10 мМ NH₄Cl в качестве источника азота, pH 6,5. Далее мицелий переносят в раствор 1.2 М MgSO₄ и 10 мМ NaH₂PO₄, pH 5,8 и добавляют лизирующие ферменты Trichoderma reesei до концентрации 3 мг/мл. Протопластирование проводят в течение 1ч при 30^oC при перемешивании. Протопласты собирают центрифугированием в ступенчатом градиенте плотности 0,6 М сорбитола, промывают 2 раза в стабилизирующем растворе, содержащем 1,2 М сорбитола, 10 мМ Трис, pH 7,5, 10мМ CaCl₂ и суспендируют в нем же при концентрации 10⁸ протопластов/мл. Трансформацию проводят следующим образом: в 100 мкл суспензии протопластов добавляют 1 мкг ДНК плазмиды pSTA10 (Unkles et al. 1989), несущей в качестве селективного маркера ген нитратредуктазы Aspergillus niger, и 10-20-кратный избыток плазмиды pPCG12 с геном b-галактозидазы Penicillium canescens, инкубируют при комнатной температуре 20 мин, после чего проводят осмотический шок 5 мин в 50%-ном растворе полиэтиленгликоля и высевают протопласты на среду следующего состава: 1,2 М сорбитола, агаризованная среда Чапека с 10 мМ NaNO₃. Через 4-5 сут инкубации при 30^oC проводят скрининг полученных контрансформантов, анализируя уровень b-галактозидазной активности в культуральной жидкости при глубинном культивировании на среде со свекловичным жомом и БВК (см. пример 3). Наиболее продуктивным является штамм PCG12-38.

Пример 3. Ферментация штамма Penicillium canescens PCG12-38, и оценка его продуктивности.

Для получения исходного посевного материала культуру штамма PCG12-38 выращивают на агаризованной среде Роулен-Тома при 30^oC в течение 5-7 сут. Водной суспензией конидий (10⁷ конидий/мл) инокулируют 100 мл ферментационной среды, содержащей свекловичный жом 30 г/л, белково-витаминный концентрат 50 г/л, KH₂PO₄ 25 г/л, pH 4,5. Культивирование проводят в колбе Эрленмейера при 30^oC 96 часов на круговой качалке, при 240-250 об/мин. По окончании ферментации культуральную жидкость отделяют от мицелия и твердых остатков среды центрифугированием (10000g, 15 мин) и в супернатанте определяют активность b-галактозидазы. Реакционную смесь, содержащую 3 мг ОНФГ в 1,9 мл 50мМ Na-ацетатного буфера pH 4,5 и 100 мкл культуральной жидкости соответствующего разведения, инкубируют 15 мин при 30^oC, а затем добавляют 1 мл 1М Na₂CO₃ и измеряют оптическую плотность раствора при 420 нм. За единицу активности b-галактозидазы принимают количество фермента, которое освобождает из субстрата 1 мкмоль О-нитрофенола в 1 мин при данных условиях реакции. Активность фермента за 96 ч ферментации в разных опытах составляет 190-220 ед/мл.

Предлагаемое изобретение позволяет в 3-4 раза повысить продуктивность мицелиального гриба Penicillium canescens в отношении секретируемой b-галактозидазы и пропорционально увеличить ее долю среди всех белков секретируемых этим грибом. Полученный положительный эффект предлагаемого изобретения достигается за счет свойств клонированного фрагмента ДНК PCG12, несущего ген, кодирующий синтез секретируемой b-галактозидазы.

Использование: относится к микробиологической промышленности, в частности к генетической инженерии. Сущность изобретения: предлагается фрагмент ДНК PCG12, кодирующий синтез b-галактозидазы, на основе которого сконструирована плазмида pPCG12 и штамм Penicillium canescens ВКПМ F-715, являющийся продуцентом b-галактозидазы. Предлагаемый штамм за 96 ч ферментации на среде со свекловичным жомом и БВК накапливает до 190-220 ед/мл b-галактозидазы в культуральной среде. 2 с. п. ф-лы.

1. Фрагмент ДНК PCG12 размером 4,2 т.н.п. кодирующий синтез β-галактозидазы Penicillium canescens 20171, полученный путем выделения из фаговой библиотеки генов Penicillium canescens 20171 с помощью синтезированных олигонуклеотидных зондов с нуклеотидной последовательностью 5′TCAG

TCCCAIGTIACAGTATCCCTCTG 3′, и 5'GATGGTGAAGCCATCCAACTTATG 3', с 5'регуляторной областью с нуклеотидной последовательностью 5' концевой части гена β-галактозидазы: (см. стр. 211)
2. Штамм грибов Penicillium canescens ВКПМ F-715 продуцент β-галактозидазы.