Штамм бактерий BacILLUS меGатеRIUм-продуцент металлопротеиназы Советский патент 1988 года по МПК C12N9/52 C12N1/20 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к производству ферментов, и касается нового штамма бактерий, продуцирующего внеклеточную металлопротеиназу (нейтральную протеиназу).

Металлопротеиназы IimpoKo используются в народном хозяйстве и могут применяться в медицине и парфюмерии при производстве пищевых продуктов и напитков., кожевенной промьгашен- ности.

Штамм Bacillus megaterium ВКПМ В-3937 получен из штамма Bacillus megaterium ЦМПМ В-603 в результате применения селекционньзс методов с использованием молочного агара с добавлением дрожжеполисахаридной среды в качестве селективного фактора.

При культивировании на дрожжеполисахаридной среде в течение 23-25 ч при штамм BKIIM В-3937 вьщеляет только один фермент - металлопротеиназу, активность которого по,гидролзу азоказеина достигает 160 ед/мл, а при определении на синтетическом субстрате 1,8 ед/мл, что соответствует продукции 500 мг фермента на 1 л культуральной жидкости. Протео- литическая активность на казеиновом субстрате по модифицированному -методу Ансона составляет в среднем 9,4 ед/мл (с колебаниями активности от 7,6 до 12,6 ед/мп),

Металлопротеиназа (нейтральная протеиназа), продуцируемая с помощь штамма BKIM В-3937, обладает устойчивостью к ингибированию высокими концентрациями реагентов, что отличает ее от металлопротеиназ, секре- тируемых другими видами микроорганимов. Эта специфическая особенность фермента является важной для ее использования в народном хозяйстве при синтезе интенсивного подсластителя - аспартама.

Культурально-морфологические принаки штамма Boinegaterium ВКПМ В-393

Морфология. Грамположительная палочка размером 2,0x5,0x1,,5 мкм. Образует овальные споры с центральным расположением в клетке.

Мясо-пептонный агар (МПА) без глюкозы. На 4-е сут роста при 30°С образует плоские шероховатые проз рачные колонии диаметром 9-10 мм с ровными краями, пигмент не вьщеляет, споры не образует.

0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

Мясо-пептонный агар с 1%-ной глюкозы и агар Хоттингера с 1%-ной глюкозы. На 4-е сут роста при 30 С образует приподнятые над субстратом колонии диаметром 7-8 мм гладкие-; блестящие с ровными краями беловато- серого цвета, пигмент в среду не вьщеляет, обильно спорулирует.

Среда Bergey № 1 с дрожжевым экстрактом. На 4-е сут роста при 30 С образует матовые плоские в центре мелкоскладчатые к краю колонии диаметром 9-10 мм с фестончатыми краями белого цвета, пигмент в среду не вьщеляет, споры не образует.

Синтетическая среда Green и Slepecka. На 4-е сут роста при образует белые блестящие колонии диаметром 3-4 мм с ровными краями, образует споры.

Молочная среда. На 4-е сут роста при 30 С образует плоские шероховатые колонии диаметром 7-9 мм матовые белого цвета с poBHbihm краями, пигмент в среду не вьделяет, споры образует.

Среда L + глюкоза 1%. На 4-е сут роста при 30 С образует плоские шероховатые матовые колонии диаметром 13-15 мм белого цвета с ровными краями, пигмент в среду не вьщеляет, споры образует.

Казеиновая среда. На 2-е сут роста при 30°С образует гладкие блестящие колонии диаметром 13-14 мм белого цвета с ровными краями, пигмент в среду не вьщеляет, обильно спорулируето На 3- 4-е сут отмечается лизис культуры.

Посев уколом в столбик с казеиновой средой. Сплошной рост на поверхности столбика, внутри агара рост отсутствует - аэроб.

Рост в жидких питательных средах. При посеве на жидкую питательную -сред;у МПВ с глюкозой и среду Bergey № 1 с глюкозой без встряхивания наблюдается слабое помутнение среды, пленка отсутствует, образуется осадок скудньш рыхльй слизистьм.

Картофель. Рост обильньй, поверхность слизистая серовато-белого цвета, пигментация отсутствует.

Биохимические свойства.

Желатину активно разжижает.

Молоко пептонизирует и коагулирует о

1440921 нитриты.

Нитраты восстанавливает в

Крахмал гидролизует.

Отношение к углеводам и спиртам. сваивает арабинозу, глюкозу, ксило у, маннозу,- лактозу, мальтозу, гаактозу, сахарозу, маннит, глицерин.

На 6-7 день роста при 30 С на глюкозе, глицерине, сахарозе, мальтозе и арабинозе сильно подкисляет среду, на лактозе, галактозе и ман- ните подкисление среды слабое, на аннозе и ксилозе рН не меняется. ост на ксилозе и галактозе сопровождается вьщелением газа.

Отношение к лизolц мy. Воздействие л,изрцимом в концентрации 40 мг/мл в течение 1 ч при 37°С вызывает гибель 63% клетоко

Штамм хранят в виде лиофильно высушенной культуры, а также на ага- изованной картофельной среде с 2%- ной глюкозы, среде L с 1%-ной глюкозы, под вазелиновым маслом и в гли- - церине.

Пример 1. Штамм B.megaterium КПМ В-3937 выращивают в течение 4-5 сут на картофельном агаре - срее с картофельным отваром (300 г картофеля на 1 л воды), : содержащем % глюкоза 2,0, агар-агара 2,0, осталь-, ное картофельный отвар до 1л, рН 7.О..

Засев питательной среды проводят ли вегетативными клетками, или суспензией спор, которую подвергают предварительной термообработке при 65 С в течение 15 мин в количестве 10 на 1 МП среды.

В качестве ферментационной среды используют дрожже-полисахаридную (ДПС) среду следующего состава, мас.%:

Велково-витаминный

концентрат из дрож- . жей2,5-3,0

си ло ра 10 пр су с та 15 пр по до

20

к во но 25 об

пр но ку

ни ср но сп не та

зр

35

40

Ф

ВК ин

1

Кукурузная мука 2,0 CaCli0,3

Вода - До 1 л рН 7,5-7,6 до стерилизации,

Через 23 ч культивирования максимальный уровень накопления метал- лопротеиназы в супернатанте куль.ту- ральной жидкости составляет 1,8 ед/мл при определении на синтетическом субстрате DNP-Gly-Gly-Ile-Arg и 160 ед/мл при определении активности с использованием в качестве субстрата азоказеина, что соответствует продукции 500 мг на 1л. Активность по модифицированному методу Анеона достигает 9,4 ед/мл.

Пример 2. Выращенную в колбах по примеру 1 культуральную жидкость B.megaterium ВК1ГМ В-3937 6-часового возраста пересевают в 10-лит-. ровьй ферментер на опытно-промышленной установке в количестве 10% по объему.

Культивирование в аппарате ведут при аэрации 1:1 и перемешивании 800 об/мин при . В качестве пе- ногасителя используют ниоген. Через 27 ч роста количество фермента в культуральной жидкости составляет 500 мг/л.

Применение штамма с использованием простой относительно дешевой среды позволяет увеличить рентабельность промьшшенного производства специфической металлопротеиназы, необходимой для производства аспар- тама„

Формула изобретения

Штамм бактерий Bacillus megaterium ВКПМ В-3937 - продуцент металлопротеиназы.

Изобретение относится к биотех- . нологии и может применяться в различных отраслях народного хозяйства и медицине. ГГредлагается штамм Bacillus megateriun BKIIM В-ЗЧ37-продуцент металлопротеиназы, получен с помощью селекционных методов из штамма В.те- gaterium ЦМ1М В-603 с использованием молочного агара с добавкой дрож- жеполисахаридной среды в качестве селективного фактора. Штамм-продуцент BKIIM-3937 за 23-25 ч культивирования при 30°С с интенсивной аэрацией и перемешиванием секретирует металлопротеиназу в количестве 500 мг/л культуральной жидкости, что в 2 раза больше по сравнению с из - BectHbM штаммом В.negaterшто-проду- центом металлопротеиназыо Специфическая металлопротеиназа, выделяемая культурой B.megaterium, может быть использована при производстве аспартама-пищевого подсластителя, которьй в 200 раз слаще сахара. (Л . 4 О ;О to

Редактор М.Недолуженко Техред А.Кравчук

Заказ 6143/29Тираж 520Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Корректор Л.Патай