ШТАММ БАКТЕРИЙ BREVIBACTERIUM FLAVUM - ПРОДУЦЕНТ L-ГЛУТАМИНА (ВАРИАНТЫ) Российский патент 1997 года по МПК C12N1/20 C12P13/14 C12N1/20 C12R1/13 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается способа получения l-глутамина при выращивании продуцирующих его штаммов микроорганизмов на питательных средах, содержащих углеводы. L-глутамин находит применение в медицинской, химической и косметической промышленности, а также как пищевая добавка.

Один из известных микробиологических способов получения глутамина основан на использовании штаммов продуцентов глутаминовой кислоты, которые в особых условиях культивирования продуцируют L-глутамин [1] Наиболее высокий уровень накопления глутамина (46,5 г/л) достигнут у штамма Microccocus glutamicus АТСС 14752 на среде с 15% глюкозы за 96 ч культивирования. Недостатками способа являются сложные по составу питательные среды и длительная ферментация.

Для получения L-глутамина применяют также мутанты нескольких видов глутаматпродуцирующих коринебактерий, в частности Brevibacterum flavum, Corinebacterum glutamicum, устойчивые к сульфамидам. Штамм B.flavum FERM P-1684, устойчивый к сульфагуанидину, продуцировал за 48 ч культивирования на среде с глюкозой 33 г/л глутамина, а на среде с ацетатом как источником углерода 42 г/л [2] Этот штамм является ближайшим аналогом штаммов, предлагаемых в настоящем изобретении.

В указанных способах получения L-глутамина питательные среды содержат в качестве источника углерода глюкозу, этанол, ацетат, а также витамины: биотин, тиамин и питательные добавки в составе гидролизата соевой муки. Не показана возможность использования в качестве источника углерода более дешевых компонентов: сахарозы или пищевого сахара, а в качестве источника витаминов
кукурузного экстракта.

Нашей задачей является получение L-глутамина в высоких концентрациях на простых по составу питательных средах, содержащих в качестве источника углерода сахарозу или пищевой сахар, а в качестве источника витаминов - кукурузный экстракт. Задача достигается созданием новых мутантных штаммов Brevibacterum flavum ВНИИгенетика 50-72 и ВНИИгенетика 115, которые депонированы во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов и имеют регистрационные номера ВКПМ В-3757 и В-6642 соответственно.

Новые штаммы получены из штамма дикого типа B.flavum ATCC 14067 в результате нескольких этапов селекции с применением N-метил-N-нитро-N-нитрозогуанидина в качестве мутагенного фактора. На первом этапе клетки штамма дикого типа ATCC 14067 после обработки нитрозогуанидином (250 мкг/мл, 30 мин) были высеяны на минимальную агаризированную среду, содержащую 0,5 мг/мл сульфагуанидина (СГ). Отобранный мутант, устойчивый к сульфагуанидину и продуцирующий глутамин на среде с сахарозой, был использован как родительский штамм для второго этапа селекции с применением более высокой концентрации СГ-1,5 мг/мл. После проверки полученных мутантов на способность к накоплению L-глутамина был отобран штамм ВНИИгенетика 50-72 (ВКПМ В-3757), продуцирующий до 25 г/л за 70 ч культивирования.

На следующем этапе селекции этому штамму была введена мутация устойчивости к аналогу глутамина азасерину, не применявшемуся ранее в селекции продуцентов этой аминокислоты. Для этого клетки штамма ВНИИгенетика 50-72 были обработаны мутагеном, как указано выше, и высеяны на минимальную среду, содержащую 0,3 мг/мл азасерина (АС). Среди устойчивых к азасерину мутантов был отобран штамм ВНИИгенетика-115. (ВКПМ В-6642), продуцирующий до 35,5 г/л L-глутамина за 70 ч.

Новые штаммы, кроме отношения к азасерину, не имеют существенных различий в культурально-морфологических и физиолого-биохимических признаках и поэтому далее описаны вместе.

Культурально-морфологические признаки. Клетки овальные, размеры 1,0-2,0 х 0,5-1,0 мкм, неподвижные, грамположительные, спор не образуют.

Через 3-5 суток роста при 30^oC на МПА или агаре Хоттингера колонии диаметром 3-4 мм, кремовые, поверхность гладкая, форма выпуклая, край ровный, структура однородная, тестообразная. При посеве уколом рост в глубине агара слабый, на поверхности умеренный.

Через 3-5 суток роста 30^oC на глюкозо-минеральной среде Гловера, содержащий биотин и тиамин, колонии 1-2 мм, край ровный, структура однородная, консистенция тестообразная, поверхность гладкая, цвет колоний белый. Рост штриха через двое суток на этой среде умеренный.

Физиолого-биохимические признаки.

Аэроб. Желатину не разжижает.

Хорошо растет на глюкозе, сахарозе, мальтозе, фруктозе, маннозе, этаноле, уксусной кислоте. Не растет на ксилозе, арабинозе, лактозе. Усваивает азот в форме солей аммония и мочевины. Не усваивает нитратный азот.

Растет при температуре 24-34^oC. Оптимальная температура 30^oC.

Растет на средах с pH от 6 до 8,5. Оптимальное значение pH 6,8-7,2.

Для роста в минимальной среде нуждается в биотине, тиамине.

Устойчивость к антиметаболитам. Штамм В-3757 устойчив к сульфагуанидину, а штамм В-6642 устойчив к сульфагуанидину и азасерину.

Штаммы хранятся при температуре 4^oC на скошенной агаризованной среде Хоттингера в течение 3 месяцев или в лиофильно высушенном состоянии в ампулах в течение 1 года.

Получение L-глутамина с использованием штаммов B.flavum ВВ3757 и В-6642 осуществляется следующим образом.

Культуру штамма выращивают на агаризованной полноценной среде, затем высевают в колбы с посевной средой для выращивания посевного материала. После засева культуры колбы устанавливают на круговую качалку с 220-250 об/мин при 30^oC. После инкубации готовый посевной материал вносят в колбы или ферментеры с ферментационной средой, содержащей источники углерода, азота, витамины и минеральные соли. Все компоненты стерилизуют под давлением. Ферментацию проводят в колбах на качалке или в ферментере, оборудованнoм системой перемешивания, аэрирования и термостатирования.

Концентрация L-глутамина в культуральной жидкости в конце ферментации достигает 35,5 г/л. Препарат кристаллического L-глутамина из ферментационного раствора получают известными способами.

Пример 1.

Культуру В-6642 выращивают в течение 24 ч при 30^oC на мясо-пептонном агаре. Петлей засевают 50 мл посевной среды, помещенной в колбы емк. 750 мл. Состав посевной среды (%): сахароза-4,0, сернокислый аммоний-2,5, однозамещенный фосфорнокислый калий 0,05, сернокислый магний семиводный-0,03, кукурузный экстракт-1,0, мел-1,0, pH среды-7,4. Колбы инкубируют на круговой качалке (250 об/мин) при 30^oC в течение 20 ч. Готовым посевным материалом в количестве 5% по объему ферментационной среды засевают колбы емк. 750 мл, содержащие 30 мл ферментационной среды следующего состава (%): сахароза -12,0, сернокислый аммоний (стерилизуется отдельно в виде 50%-ного раствора и вносится в среду перед засевом)-7,0, однозамещенный фосфорнокислый калий-0,25, сернокислый магний семиводный-0,04, кукурузный экстракт-0,5, тиамин-0,00035, мел-4,0, pH среды- 7,2. Ферментацию проводят на круговой качалке (250 об/мин) в течение 70 ч. К концу ферментации концентрация L-глутамина составляет 33,2 г/л.

Пример 2.

Посевной материал готовят по примеру 1, но в составе посевной среды вместо сахарозы используют пищевой сахар. Ферментацию также проводят по примеру 1, но в составе ферментационной среды вместо сахарозы используют пищевой сахар и не вносят тиамин. Через 70 ч концентрация L-глутамина составляет 35,5 г/л.

Пример 3.

Посевной материал готовят по примеру 2. Посевным материалом в количестве 5% по объему засевают лабораторный ферментер емкостью 3 л, содержащий 1,5 л ферментационной среды, описанной в примере 2. Ферментацию проводят при 30^oC, скорость вращения мешалки 800 об/мин, подача воздуха 0,5 объема на объем среды в мин. Через 70 ч концентрация L-глутамина достигает 34,3 г/л.

Пример 4.

Культуру штамма B.flavum B-3757 выращивают по примеру 1, после чего засевают посевную среду следующего состава (%): меласса-8,0, хлористый аммоний-0,5, сернокислый аммоний-0,5, однозамещенный фосфорнокислый калий-0,05, сернокислый магний семиводный-0,03, кукурузный экстракт-0,3, мел-1,0, pH среды-7,4. Выращивание посевного материала проводят по примеру 1. Посевным материалом в количестве 5% по объему от объема ферментационной среды засевают лабораторный ферментер емкостью 0,6 л, содержащий 0,4 л ферментационной среды, описанной в примере 1. Ферментацию проводят при 30^oC, скорость вращения мешалки 800 об/мин, подача воздуха 1 объем на объем среды в мин. Через 70 ч концентрация L-глутамина достигает 25,0 г/л.

Использование: биотехнология, производство аминокислот. Сущность изобретения: новые штаммы бактерий Brevibacterium flavum ВКПМ В-3757 и Brevibacerium flavum ВКПМ В-6642, продуцирующие L-глутамин в значительных количествах. Селекционным путем получены новые мутантные штаммы, устойчивые к сульфагуанидину и азасерину. Культивирование этих штаммов на средах, содержащих в качестве источника углерода сахарозу или пищевой сахар, позволяет получать до 35,5 г/л L-глутамина. Описаны культурально-морфологические и физиолого-биохимические свойства штаммов. 2 с.п. ф-лы, 1 табл.

1. Штамм бактерий Brevibacterium Flavum ВКПМ В-3757-продуцент L-глутамина. 2. Штамм бактерий Brevibacterium flavum ВКПМ В-6642 продуцент L - глутамина.