СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ШТАММА МИКРООРГАНИЗМА - ПРОДУЦЕНТА БИЦИТРАЦИНА Российский патент 1994 года по МПК C12N15/01 

Изобретение относится к синтезу биологически активных веществ и может быть использовано при получении новых свойств продуцентов антибиотиков посредством индуцированного мутагенеза с помощью энергичных частиц пучково-плазменного разряда, возбуждаемого высокоэнергичными электронами и тормозным рентгеновским излучением.

Изобретение может быть применено в микробиологической промышленности, например, для повышения антибиотической активности штамма Bacillus licheniformis - продуцента бацитрацина.

Известен способ повышения выхода мутаций зерновых культур с помощью комбинированной обработки гамма-излучением и магнитным полем, заключающийся в том, что микроорганизмы облучают магнитным потоком 0,08Т и гамма-излучением в дозе до 300 Гр.

Недостатком данного способа является высокая эффективность при воздействии на Bac. licheniformis, низкая стабильность положительных свойств при технологическом использовании продуцента.

Известен способ получения штаммов-продуцентов бацитрацина, предусматривающий обработку штамма B. licheniformis химическим мутагеном, в частности W-метил W'-нитро N-нитрозогуанидином, воздействие фагом N 12 с последующим отбором клонов, обладающих большей биологической активностью культуральной жидкости [1] .

Современные исследования дают некоторые представления о процессах восстановления клеток и их генетических структур, от повреждений, вызываемых ионизирующей радиацией и о процессах задержки восстановления этих структур, например, электромагнитным и магнитными полями.

Недостатком всех известных способов является невозможность создания воздействий на Bac. licheniformis, повышающих биологическую активность микроорганизма более чем на 5-6% и нестабильность прироста биологической активности во времени.

Цель изобретения - повышение биологической активности штамма-продуцента и ее стабилизации.

Цель достигается путем облучения культуры Bac. licheniformis ионизирующим излучением и последовательного отбора наиболее активных вариантов продуцента. Отличие состоит в том, что культуру Bac. licheniformis облучают энергичными электронами с регулируемыми параметрами: энергии 350 - 400 КэВ, плотность тока (5˙ 10^-4 - 6,0) А/см², длительность импульса облучения 0,5 - 50˙ 10^-9 с, пауз между облучения 1-4 с, причем доза облучения питательной среды с культурой: Bacillus licheniformis составляет (10^-2-2,5) Мрад; затем дополнительно подвергают воздействию импульсным тормозным рентгеновским излучением с энергией 200-300 КэВ, 5-15 импульсов, длительностью 50˙ 10^-9 с с паузами между импульсами 10-30 с. При выходе за пределы указанных параметров цель не достигается. В частности, при энергии ниже 350 КэВ электроны плохо проникают через культуральную среду и при этом снижается вероятность возникновения мутагенных явлений. При энергии выше 400 КэВ энергичные электроны хотя и доходят до генетических структур клетки, но сечение столкновений при этой энергии падает настолько, что приводит к снижению количества мутаций.

При плотности тока выше 6 А/см² цель не достигается, так как плотность электронов становится настолько велика, что приносимая ими энергия приводит к гибели продуцента бацитрацина. При плотностях тока менее 5˙ 10^-4 А/см мутации практически не заметны. При длительности облучения более 0,5 с цель не достигается, так как происходят необратимые явления в культуральной жидкости и в связи с этим число мутаций снижается до естественного уровня. При длительности менее 50˙ 10^-9 с прирост биологической активности оказывается нестабильным даже при последующей обработке рентгеновским излучением в указанных выше пределах. При паузе между импульсами более 4 с происходит достаточное число мутаций, но при этом прирост биологической активности продуцента бацитрацина не сохраняется ни при каких режимах обработки тормозным рентгеновским излучением.

При паузе менее 1 с возникают эффекты нагрева культуральной жидкости, что приводит к снижению прироста биологической активности жидкости и повышенному проценту летального исхода культуры. При дозах более 2,5 Мрад наступает стойкая стерилизация всей культуральной жидкости (гибель продуцента). При дозах менее 10^-2 Мрад. число мутаций остается на естественном уровне. Последующая обработка облученного электронами продуцента бацитрацина импульсным тормозным рентгеновским излучением позволяет удержать стабильным прирост биологической активности микроорганизмов. При уменьшении любого из перечисленных значений тормозного рентгеновского излучения прирост биологической активности продуцента бацитрацина падает, причем уменьшение любого из параметров магнитного поля на 20% приводит к потере 90% прироста биологической активности в течение 30 дней.

При увеличении любого из перечисленных параметров рентгеновского излучения наступает явление значительной стерилизации микроорганизмов с потерей прироста биологической активности более чем на 80% за 30 дней.

На чертеже показано воздействие пучково-плазменного разряда на продуценты бацитрацина (штамм А-81), причем графики 1 (пример 1 описания), 2 (пример 2 описания), 3 (пример 3 описания) указывают на сдвиг А в сторону плюс-вариантов ( (ΔA+1

Способ осуществляют следующим образом: слой водной суспензии из продуцентов бацитрацина (0,3 мл) помещают в плоский полиэтиленовый пакет размером 30х30х0,1 мм³ с толщиной стенки 20-50 мкм и облучают высокоэнергичными электронами, вылетающими из ускорителя электронов через алюминиевобериллиевую диафрагму в атмосферу и на плоскость пакета под углом 90^о к поверхности его. При энергии налетающих электронов, начиная с 350-380 КэВ, при плотности тока 50-100 МА/см², внутри пакета и снаружи возникает пучково-плазменный разряд, приводящий к мутагенным явлениям в генетической структуре клеток Bacillus licheniformis. Мощность дозы и характер энергетического спектра пучка электронов регулируют электрическим режимом ускорителя, установкой угла падения пучка, длиной пролета электронов в атмосфере (Z). При монотонном изменении поглощенной дозы электронного облучения в пределах 10^-2 - 2,5 Мрад наступают состояния микромоноспор, соответствующие т. н. кривым подавления микроорганизмов, по которым можно косвенно судить о степени воздействия электронного облучения на продуцент. Процессы гибели клеток и мутагенные явления в генетическом аппарате считают взаимосвязанные между собой и эти связи поддаются количественной оценке.

При дозах облучения продуцентов бацитрацина, соответствующих предлетальным: В= 0,0999% , число мутаций максимально, причем сказываются возможными как генные, так и хромосомные мутации. После облучения продуцент бацитрацина помещают в поле тормозного рентгеновского излучения, создаваемого электронным ускорителем, питающимся импульсным током. Режим обработки выбирают исходя из дозных характеристик. После рентгеновского облучения производят рассев продуцентов в чашки Петри на агаровую среду для получения моноспоровых вариантов культуры, последующего определения их способности к образованию бацитрацина и отбора высокоактивных вариантов культуры, определения стабильности прироста биологической активности.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

П р и м е р 1. (Пассаж), кривые 1.

Готовят водную суспензию спор культуры Bac. licheniformis - продуцента антибиотика бацитрацина, с начальной средней активностью 640 ед/мл. Вносят по 0,3 мл суспензии в два полиэтиленовых пакета с размерами 30х30х0,3 мм³ с толщиной полиэтиленовой пленки 40 мкм так, чтобы толщина слоя культуральной жидкости была около 200-300 мкм. Пакеты закрывают герметично горячим роликом. Первый пакет (камеру) помещают в плазменный реактор перед выпускным окном электронной пушки так, чтобы до плоскости выпускной диафрагмы было расстояние Z= 3 мм. Устанавливается угол падения электронного пучка 90^о.

Облучают первый пакет с суспензией в режиме: энергия электронов 350 КэВ, плотность тока 5 ˙ 10^-4 А/см², длительность импульсов 0,5 с пауза 1 с, число импульсов устанавливается таким, чтобы поглощенная доза на весь пакет составляла 10^-2 Мрад. По истечении 5-7 мин после облучения пакет с культуральной жидкостью помещают в импульсное поле тормозного рентгеновского излучения, Е= 300 КэВ, 10 импульсов, длительностью 5х50 10^-9 с с паузами 10 с. Второй пакет (контроль) не облучается и не подвергается воздействию тормозным рентгеновским излучением. После облучения производят рассев спор в чашки Петри на агаровую среду следующего состава, % : Агар-агар - 20, Мясопептонный бульон чашки Петри при выращивании моноколоний помещают в термостат при температуре 37+1^оС на 7 сут.

Выросшие моноколонии (не менее 100 шт. ) пересеивают в пробирки на косой агар - среда МПА, 2% и инкубируют их в термостате при той же температуре в течение 7 сут.

Для проверки активности монокультур производят засев кусочком культуры с косяка в посевные колбы, содержащей 100 мл посевной среды следующего состава, % : Соевая мука 7,5 Крахмал 1,8 Мел 0,2 Аммоний сернокислый 0,2 Вода водопроводная рН 7,0-7,2 Посевную культуру выращивают 18 ч при 30+1^оС на качалке (220 качаний в минуту). Выросшей культурой засевают (в количестве 5% по объему) 35 мл ферментативной среды (в качальных колбах) следующего состава, в % : Соевая мука 7,5 Крахмал 2,0 Мел 0,5 Магний сернокислый 0,1 Кальций хлористый 0,03 Вода водопроводная рН 7,0-7,2 Биосинтез ведут при 37 - 1^оС на качалке (220 качаний в минуту) 32 - 34 ч.

Определяют активность биологическим методом и отбирают варианты с активностью не менее 640 ед/мл. Отобрана культура штамма со средней биологической активностью 685 ед/мл. Биологическая активность контроля (опыт 2) оказалась на уровне 640 ед/мл.

П р и м е р 2. (Пассаж) кривая 2.

Полученную в примере 1 культуру штамма со средней биологической активностью 685 ед/мл используют для приготовления суспензии Bacillus licheniformis в воде. Наливают по 0,3 мл водной суспензии в два предварительно стерилизованных полиэтиленовых пакета с размерами 30х30х0,1 м³ с толщиной стенки 40 мкм. Толщина культуральной жидкости при этом составляет 100-150 мкм.

Укрепляют первый пакет в юстировочное устройство пучково-плазменного реактора перед выпускным окном электронного ускорителя так, чтобы до плоскости выпускной диафрагмы было расстояние 17 мм. Закрывают реактор свинцовой заслонкой. Облучение первого пакета производят в режиме: угол падения 90^о, энергия электронов 380 КэВ, плотность тока электронов 6 А/см², длительность импульса 10^-4 с, пауза 4 с, доза облучения - 2,5 Мрад. По истечении 10 мин после облучения пакет с культуральной жидкостью помещают в импульсное тормозное рентгеновское излучение Е= 250 КэВ, 10 имп. х50 ˙ 10^-9 с, с паузами 30 с. Второй пакет не облучают и не обрабатывают рентгеновским излучением. После облучения производят рассев спор. Выделение монокультуры и определение их активности как указано в примере 1. Отбирают высокоактивные варианты, средняя биологическая активность возросла с 685 до 730 ед/мл.

П р и м е р 3. (Пассаж), кривая 3.

Полученную в примере 2 культуру со средней биологической активностью 730 ед/мл используют для приготовления суспензии спор в воде. Наливают 0,3 мл суспензии в две предварительно стерилизованных полиэтиленовых камеры с размерами 30х30х0,1 мм³ с толщиной полиэтиленовой пленки менее 40 мкм и заваривают горячим роликом. Устанавливают камеру в пучково-плазменный реактор перед выпускным окном электронного ускорителя так, чтобы до плоскости выпускной диафрагмы было расстояние 30 мм, угол падения электронного луча 80^о. Облучают камеру с суспензией в режиме: энергия электронов 400 КэВ, плотность тока 2 А/см², длительность импульсов 50 ˙ 10^-9 с, пауза 2 с, при этом дозу облучения устанавливают 0,5 Мрад. Переворачивают камеру другой стороной к выпускной диафрагме и облучают ее в том же режиме с дозой облучения 0,3 Мрад. По истечении 30 мин после облучения камеру с культуральной жидкостью помещают в импульсное поле тормозного рентгеновского излучения с Е = 200 КэВ, 15 имп. по 50˙ 10^-9 с, с паузами 20 с.

После обработки производят рассев спор, выделение монокультур, определение их активности и стабильности морфологических свойств, как указано в примере 1. Выбирают высокоактивные варианты. Биологическая активность культуральной жидкости составляет 770 ед/мл (18480 мкГ/мл). Прирост биологической активности стабилен.

Описанные примеры подтверждаются экспериментами, результаты которых представлены на графиках. Из графиков виден ход приращения плюс вариантов биологической активности продуцента, причем при отклонении от указанных режимов (например, кривая 4) могут наступать и негативные явления: сдвиг в сторону минус-вариантов.

Таким образом, если в прототипе активность продуцента повысилась на 5 - 6% , то в предлагаемом техническом решении на 20% - с гарантированной стабильностью.

Повышение биологической активности штамма Bacillus licheniformis позволяет увеличить съем готового продукта с ферментационной емкости производства. (56) Авторское свидетельство СССР N 497333, кл. С 12 Р 21/04, 1974.

Использование: синтез биологически активных веществ, получение новых свойств продуцентов антибиотиков посредством индуцированного мутагенеза с помощью энергичных частиц пучково-плазменного разряда, возбуждаемого высокоэнергичными электронами и тормозным рентгеновским излучением. Сущность изобретения: способ получения высокоактивных штаммов микроорганизма - продуцентов бацитрацина путем облучения культуры Bacillus licheniformis заряженными частицами пучково-плазменного разряда и последовательного отбора наиболее активных вариантов продуцента, что позволяет существенно повысить биологическую активность микроорганизмов. Культуру, помещенную в полиэтиленовую камеру, облучают при атмосферном давлении электронами с энергией 350 - 400 КэВ дозами до 2,5 Мрад, после чего подвергают воздействию импульсным рентгеновским излучением с энергией квантов 200 - 300 кЭв, при этом активность продуцента повышается на 20 % и остается стабильной. С помощью предложенного способа была повышена исходная биологическая активность продуцента бацитрацина - штамма А-81- с 640 ед/мл до 770 ед/мл. Варьируя дозой облучения электронами и энергией квантов тормозного рентгеновского излучения, можно, при многократной обработке микроорганизмов, получить штаммы B. licheniformis, которые позволяют увеличивать съем готового продукта с ферментационной емкости производства. 1 ил.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ШТАММА МИКРООРГАНИЗМА - ПРОДУЦЕНТА БИЦИТРАЦИНА, предусматривающий обработку штамма Bacillus licheniformis мутагеном и последовательный отбор наиболее активных вариантов продуцента, отличающийся тем, что, с целью повышения биологической активности продуцента и ее стабилизации, в качестве мутагена используют комбинированное ионизирующее излучение, при этом вначале культуру облучают энергичными электронами пучково-плазменного разряда с регулируемыми параметрами энергии частиц 350 - 400 КэВ, плотностью тока 5 · 10^-4 - 6,00 А/см² в возбуждающем пучке при длительности импульса облучения 0,5 - 50·10^-9 с с паузами между импульсами 1 - 4 с, причем доза облучения суспензии спор составляет 1 · 10^-2 - 2,5 Мрад, затем дополнительно подвергают воздействию импульсным тормозным рентгеновским излучением с энергией 200 - 300 кэВ 5 - 15 импульсами длительностью 50 · 10^-9 с с паузами между импульсами 10 - 30 с.