СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ШТАММА АКТИНОМИЦЕТА - ПРОДУЦЕНТА ЛИНКОМИЦИНА Советский патент 1995 года по МПК C12N15/01 

Изобретение относится к синтезу биологически активных веществ и может быть использовано при получении новых свойств продуцентов антибиотиков посредством индуцированного мутагенеза с помощью энергетичных частиц пучково-плазменного разряда, возбуждаемого высокоэнергетическими электронами.

Изобретение может быть применено в микробиологической промышленности, например, для повышения антибиотической активности штамма актиномицета Actinomyces roseolus продуцента линкомицина и др.

Цель изобретения повышение активности продуцентов антибиотиков линкомицина.

Результат достигается путем по крайней мере однократного облучения культуры Аctinomyces roseolus заряженными частицами и отбора наиболее антибиотических активных клонов. Отличие состоит в том, что культуру Act.roseolus облучают энергетическими электронами с регулируемыми параметрами энергии 100-250 кэВ, плотности тока 6 ˙ 10^-5-5,0 А/см², длительности импульса облучения 0,5-10^-7 с, пауз между облучением 1,5-6 с, причем доза облучения питательной среды с культурой Act.roseolus составляет 10^-3-20 Мрад.

Способ осуществляют следующим образом. Слой водной суспензии из продуцентов линкомицина (0,2-0,4 мл) помещают в плоскую полиэтиленовую камеру размером 30х30х0,1 мм³ с толщиной стенки 20-100 мкм и облучают высокоэнергетическими электронами, вылетающими из ускорителя электронов через тонкую алюминиевую диафрагму в атмосферу и на стенку камеры. Угол падения электронного потока варьируют в пределах 0< α < 180^о. При энергии налетающих электронов, начиная с 100 кэВ, и плотности тока 50-80 мкА/см² внутри камеры с эмульсией и снаружи возникает пучково-плазменный разряд, приводящий к мутагенным явлениям в генетическом аппарате микроорганизмов.

Мощность дозы и характер энергетического спектра пучка электронов регулируют электрическим режимом ускорителя, углом падения пучка, длиной пролета электронов в атмосфере.

Общий баланс плотности энергии электронного пучка при прямом падении на стенку камеры вычисляют из уравнения
Е_р^м + Е_у^м Е_у (Е_ф + Е_в + Е_к), (1) где Е_р^м+Е_у^м энергия электронов, приводящая к эффекту индуцированного мутагенеза под воздействием энергетических частиц пучково-плазменного разряда (Е_р^м) и прямых электронов ускорителя (Е_у^м);
Е_у энергия электронов пучка в вакуумной трубке ускорителя;
Е_ф + Е_в +Е _к потери энергии электронов пучка в выпускной фольге (Е_ф), атмосфере (Е_в), в стенке камеры (полиэтилена) (Е_к).

При монотонном изменении поглощенной дозы электронного облучения в пределах 10^-3 20 Мрад наступают состояния спор продуцентов, соответствующие так называемым кривым подавления микроорганизмов.

Процессы гибели клеток и мутагенные явления в генетическом аппарате считают взаимосвязанными между собой и описывают исходя из определенных принятых математических моделей, которые поддаются экспериментальной проверке, так как они связывают происходящие явления с молекулярными поражениями, которые можно количественно оценить. Например, можно учесть число одиночных разрывов и двойных разрывов в спиралях ДНК либо одиночные разрывы в комплементарных ДНК, расположенных друг против друга, и созданных статистически независимо отдельными электронами.

Исходя из соображений для продуцентов линкомицина можно записать
В/В_о= exp (αД-β Д²), (2) где В фракция выживших клеток продуцентов антибиотика после облучения в дозе Д;
В_о фракция контрольных клеток;
α и β параметры одиночных и двойных событий (описывают эффективность индукции и регенерации одно и двухнитиевых разрывов ДНК).

При увеличении дозы облучения продуцента антибиотика выживаемость популяции, начиная с некоторого порога, для Act.roseolus после дозы 12,5 крад, начинает уменьшаться.

При дозах, соответствующих предлетальным (В=0,0999%), число мутаций возрастает более чем в 500 раз, причем оказываются возможными как генные, так и хромосомные мутации и повороты участков хромосомы на 180^о.

После облучения производят рассев спор в чашки Петри на агаровую среду для получения моноспоровых вариантов культур, последующего определения их способности к образованию линкомицина и отбора высокоактивных вариантов культуры.

П р и м е р 1. Готовят водную суспензию споркультуры Act.roseolus продуцента антибиотика линкомицина с начальной средней активностью 3500 мкг/мл.

Вносят по 0,3 мл суспензии в два полиэтиленовых пакета с размерами 30х30 мм с толщиной полиэтиленовой пленки 40 мкм так, чтобы толщина слоя культуральной эмульсии была около 200-300 мкм. Пакеты закрывают герметично горячим роликом.

Первый пакет (камеру) помещают в плазменный реактор перед выпускным окном электронного ускорителя так, чтобы до плоскости выпускной диафрагмы было расстояние 2 мм. Устанавливается угол падения электронного пучка 90^о.

Облучают первый пакет с суспензией в режиме: энергия электронов 100 кэВ, плотность тока ≈ 60 мкА/см²; длительность импульсов 0,5 с; пауза 3 с, число импульсов 300.

При этом доза будет составлять 20 Мрад на всю культуральную суспензию. Второй пакет, контрольный, не облучается.

После облучения производят рассев спор в чашки Петри на агаровую среду N 6 следующего состава, г/л воды: Кукурузный экстракт 10,0 Крахмал 10,0 Натрий хлористый 3,0 Аммоний сернокислый 3,0 Мел 2,5 Агар-агар 20,0
Чашки Петри при выращивании моноколоний помещают в термостат при температуре 27 ± 1^оС на 10 сут.

Выросшие моноколонии (не менее 100 шт.) пересевают в пробирке на косой агар среда N 6 и инкубируют их в термостате при той же температуре в течение 7 сут.

Для проверки активности монокультур производят засев кусочком культуры с косяка посевной колбы, содержащей 50 мл посевной среды следующего состава, г/л воды: Калий сернокислый 1,5 Кукурузный экстракт 20,0 Мел 5,0 Натрий хлористый 3,0 Сахар-сырец 15,0 Соевая мука 5,0 pH 6,5-6,7
Посевную культуру выращивают 48 ч при 27 ± 1^оС на качалке (200 качаний в 1 мин). Выросшей культурой засевают (в количестве 5% по объему) 40 мл ферментационной среды (в качалочных колбах) следующего состава, г/л воды: Калий сернокислый 1,5 Кукурузный экстракт 20,0 Меласса 20,0 Мел 8,0 Сахар-сырец 81,5 Соевая мука 45,0 Цинк сернокислый 0,2 Масло подсолнечное 25,0 pH 6,6-6,7 (доводят до стерилизации 40%-ным раствором едкого натра).

Биосинтез ведут при 27 ± 1^оС на качалке (200 качаний в 1 мин) 168 ч. Определяют активность биологическим методом и отбирают варианты с активностью не менее 4000 мкг/мл.

Биологическая активность контроля (пакет 2) оказалась на уpовне 3500 мкг/мл.

П р и м е р 2 (пассаж). Полученную в примере 1 культуру штамма со средней биологической активностью 4000 мкг/мл используют для приготовления суспензии Act. roseolus в воде. Наливают по 0,3 мл водной суспензии в два предварительно стерилизованных полиэтиленовых пакета с размерами 30х30х0,1 мм (камеры) с толщиной стенки 40 мкм. Толщина культуральной жидкости при этом составляет 100-150 мкм. Укрепляют первый пакет в юстировочное устройство пучково-плазменного реактора перед выпускным окном электронного ускорителя так, чтобы до плоскости выпускной диафрагмы было расстояние 10 мм. Закрывают реактор свинцовой заслонкой.

Облучение первого пакета производят в режиме: угол падения электронного пучка 120^о, энергия электронов 180 кэВ, плотность тока электронов 2 А/см², длительность импульса 0,1 мкс, пауза 1,5 с, доза облучения 0,1 Мрад. Второй пакет, контрольный, не облучают.

После облучения производят рассев спор, выделение монокультуры и определение их активности, как указано в примере 1. Отбирают высокоактивные варианты.

Средняя биологическая активность возросла с 4000 до 4550 мкг/мл.

П р и м е р 3 (пассаж). Полученную в примере 2 культуру со средней биологической активностью 4550 кг/мл используют для приготовления суспензии спор в воде. Наливают 0,3 мл суспензии в предварительно стерилизованную полиэтиленовую камеру с размерами 30х30х0,1 мм с толщиной полиэтиленовой стенки менее 40 мкм и заваривают горячим роликом.

Устанавливают камеру в пучково-плазменный реактор перед выпускным окном электронного ускорителя так, чтобы до плоскости выпускной диафрагмы было расстояние 50 мм.

Устанавливают угол падения электронного пучка 80^о. Облучают камеру с суспензией в режиме: энергия электронов 250 кэВ, плотность тока электронов 5 А/см², длительность импульсов 0,1 мкс, пауза 6 с. При этом дозу облучения устанавливают 0,5 ˙ 10^-3 Мрад.

Переворачивают камеру вокруг горизонтальной оси на 180^о и облучают ее со стороны другой стенки в том же режиме с дозой облучения 10^-3 Мрад.

После облучения производят рассев спор, выделение монокультур и определение их активности, как указано в примере 1.

Выбирают высокоактивные варианты. Биологическая активность культуральной жидкости составляет 4600-5000 мкг/мл.

Таким образом, активность продуцента повысилась в предлагаемом техническом решении на 1000-1500 мкг/мл.

Использование: генетика микроорганизма, биосинтез биологически активных веществ. Сущность изобретения: штаммы актиномицета продуцента линкомицина получены в результате облучения культуры энергетическими электронными с регулируемыми параметрами энергии 100 250 кэВ, плотности тока 6·10^-5-5,0 A/см² в возбуждающем пучке при длительности импульса облучения 0,5-10^-7 в паузах между облучением 1,5 6 с, причем доза облучения составляет 10^-3-20 Мрад.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ШТАММА АКТИНОМИЦЕТА ПРОДУЦЕНТА ЛИНКОМИЦИНА, предусматривающий облучение культуры Streptomyces roseolus заряженными частицами и отбор клонов, проявляющих большую антибиотическую активность, отличающийся тем, что культуру облучают энергетическими электронами с регулируемыми параметрами энергии 100 250 кэВ, плотности тока 6 · 10^-5 -5,0 А/см² в возбуждающем пучке при длительности импульса облучения 0,5 10^-7 с и паузах между облучением 1,5 6 с, причем доза облучения составляет 10^-3 -20 Мрад.