СПОСОБ АКУСТИЧЕСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТА ИЛИ КОЛИЧЕСТВА СУБСТРАТА В МИКРООБЪЕМАХ Российский патент 1994 года по МПК C12Q1/00 

Изобретение относится к энзимологии и может найти применение в физико-химической биологии, биотехнологии и медицине для определения активности ферментов или количества субстрата.

Известен способ акустического определения активности ферментов или количества субстрата в микрообъемах путем инкубации субстрата с ферментом, иммобилизованным на поверхности акустического резонатора, и регистрации изменений собственной частоты данного резонатора, обусловленных изменением вязко-упругих и других характеристик среды.

Недостатком известного способа является большая длительность анализа, которая обусловлена, во-первых, длительностью самого ферментативного процесса, проходящего на границе раствора и иммобилизованного вещества и требующего не менее 1 ч и, во-вторых, необходимостью предварительно иммобилизовывать новую порцию фермента на поверхности акустического резонатора перед каждым анализом, при этом процесс иммобилизации требует до 24 ч.

Другим недостатком этого способа является его низкая точность, обусловленная неопределенностью процесса иммобилизации, приводящей к неопределенной вариабельности активности иммобилизованных ферментов.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому является способ акустического определения активности ферментов или их субстратов в микрообъемах путем инкубации фермента с раствором специфического субстрата и регистрации коэффициента поглощения акустических волн в инкубационной смеси до и после окончания ферментативной реакции.

Недостатками этого способа являются низкие чувствительность и точность, а также большая длительность анализа, обусловленные измеряемым параметром. Так, изменения коэффициента поглощения при ферментативной реакции наблюдаются после двух часов реакции, а значительное снижение поглощения происходит только через пять часов, хотя другие физико-химические методы обнаруживают изменения с первых минут ферментативной реакции. Таким образом, для увеличения чувствительности измерений этим способом необходимо существенно (до пяти часов) увеличивать длительность анализа. Кроме того, зависимость коэффициента поглощения для биополимеров и их производных от молекулярной массы носит сигмоидный характер, что не позволяет достичь высокой точности измерения.

Целью изобретения является повышение чувствительности и точности способа и сокращение его длительности.

Поставленная цель достигается тем, что в известном способе акустического определения активности ферментов или количества субстрата в микрообъемах путем инкубации фермента с раствором специфического субстрата и регистрации изменений акустических свойств реакционной смеси при ферментативной реакции, регистрируют изменения скорости распространения акустических колебаний в реакционной смеси, при этом инкубацию фермента с раствором субстрата проводят непосредственно в акустической камере.

В качестве акустической камеры используют акустический резонатор, а для определения изменений скорости распространения акустических колебаний создают в камере с исследуемой средой стоячую волну и регистрируют изменения собственной частоты данного резонатора. Сравнительный анализ с прототипом показывает, что предлагаемый способ отличается от известного тем, что регистрируют изменения скорости распространения акустических колебаний в реакционной смеси, при этом инкубацию фермента с раствором субстрата проводят непосредственно в акустической камере. При этом в качестве акустической камеры используют акустический резонатор, а для определения изменений скорости распространения акустических колебаний создают в камере с исследуемой средой стоячую волну и регистрируют изменения собственной частоты данного резонатора.

Изменения скорости распространения акустических колебаний при проведении ферментативных реакций вызваны изменением степени ионизации, гидратации и упругих свойств молекул субстрата при реакции. Указанные свойства субстрата претерпевают изменения при любых ферментативных реакциях и поэтому заявляемый способ является универсальным и может использоваться для определения любых классов ферментов.

Известны технические решения, в которых концентрацию биологически важных молекул (белков, антигенов и антител) определяют по скорости распространения акустических колебаний в исследуемом растворе. В частности, для акустического измерения общей концентрации белка в крови используется метод автоциркуляции ультразвукового импульса, а для акустического определения антигенов и антител используются датчики скорости распространения поверхностных акустических волн.

Однако для количественного определения ферментов или субстратов по начальной скорости ферментативных реакций данный параметр не использовался и только экспериментальным путем удалось показать возможность определения активности фермента или концентрации субстрата по регистрации изменений скорости распространения акустических колебаний в реакционной среде.

Применение заявляемого способа позволяет повысить чувствительность и точность определения активности ферментов или количества субстрата за счет возможности измерять скорость распространения акустических колебаний в микрообъемах исследуемых жидкостей, помещенных в акустический резонатор, с точностью 10^-4% , тогда как коэффициент поглощения акустических колебаний в микрообъемах жидкостей измеряется с точностью не более 10^-2% , а также сокращения длительности анализа до 10 мин за счет определения начальной скорости ферментативной реакции, так как скорость распространения акустических колебаний является линейным параметром.

Определение активности фермента или количества субстрата в исследуемой среде проводят по калибровочной кривой, которую получают следующим образом. Раствор фермента с известной концентрацией вносят в резонаторную акустическую камеру, содержащую раствор субстрата, перемешивают, возбуждают в камере с исследуемой смесью стоячую акустическую волну, регистрируют скорость акустических колебаний в реакционной среде сразу после смешивания и через определенное время (длительность которого зависит от активности фермента) определяют разность полученных значений. Операции повторяют при использовании различных концентраций фермента или субстрата и строят калибровочную кривую.

П р и м е р 1. Калибровочную кривую для определения активности бактериальной альфа-амилазы (КФ 3.2.1.1) получают следующим образом. Готовят калибровочные растворы фермента в интервале концентраций 0,5-500 нг/мл в 0,05 М фосфатном буфере, рН 6,2. Затем 0,25 мл раствора альфа-амилазы вносят в резонаторную акустическую камеру, содержащую 0,5 мл 1% раствора крахмала в 0,05 М фосфатном буфере, рН 6,2, при 30^оС. Смесь перемешивают магнитной мешалкой, создают в камере с исследуемой средой стоячую волну и регистрируют изменения собственной частоты резонатора в области 7,3 МГц, которые линейно связаны с изменениями скорости распространения акустических колебаний в исследуемой среде. Рассчитывают разность скоростей акустических колебаний между первой и десятой минутами ферментативной реакции. Операции повторяют при использовании различных концентраций альфа-амилазы и строят калибровочную кривую.

Для анализа пробы с неизвестной активностью альфа-амилазы проводят все указанные выше операции в пятикратной повторности, но вместо раствора с известной активностью альфа-амилазы вносят анализируемый раствор и рассчитывают изменения скорости распространения акустических колебаний в анализируемом растворе. По калибровочной кривой определяют активность альфа-амилазы в исследуемой среде.

Сравнение определения активности альфа-амилазы по регистрации изменений скорости распространения (Δu) и коэффициента поглощения (Δα) акустических колебаний приведено в табл. 1.

Как видно из табл. 1 при регистрации изменения скорости ультразвука (Δu) предел обнаружения альфа-амилазы составляет 0,5 нг/мл, а погрешность измерения контрольной пробы 1% , тогда как при измерениях поглощения ультразвука (Δα) эти показатели составляют 31 нг/мл и 9% соответственно.

П р и м е р 2. Калибровочную кривую для определения активности бактериальной щелочной протеазы (КФ 3.4.21.14) получают следующим образом. Готовят калибровочные растворы щелочной протеазы в концентрации 5-640 нг/мл и вносят их в резонаторную акустическую камеру, содержащую 0,5 мл 1% раствора казеина в 0,05 М Na-карбонатном буфере рН 9,5, при 30^оС. Смесь перемешивают магнитной мешалкой, создают в камере с исследуемой средой стоячую волну, регистрируют изменения собственной частоты резонатора в области 7,3 МГц и рассчитывают разность скоростей акустических колебаний между первой и десятой минутами ферментативной реакции. Операции повторяют при использовании различных концентраций щелочной протеазы и строят калибровочную кривую.

Для анализа пробы с неизвестной активностью щелочной протеазы проводят все указанные операции, но вместо известной концентрации щелочной протеазы вносят анализируемый раствор и рассчитывают изменения скорости распространения акустических колебаний. По калибровочной кривой определяют активность щелочной протеазы в исследуемой среде.

Сравнение количественного определения щелочной протеазы по регистрации изменений скорости распространения (Δu) и коэффициента затухания акустических колебаний (Δα) при пятикратной повторности приведено в табл. 2.

Как видно из табл. 2 при регистрации изменений скорости ультразвука (Δu) предел обнаружения щелочной протеазы составляет 5 нг/мл, а погрешность измерения контрольной пробы 1,7% , тогда как при измерении поглощения ультразвука (Δα) эти показатели составляют 200 нг/мл и 16% , соответственно.

П р и м е р 3. Для определения креатина в сыворотке крови в две идентичные акустические камеры вносят по 0,65 мл исследуемой пробы. Затем в одну из камер, выбранную в качестве рабочей, вносят 0,02 мл раствора креатинкиназы (2.7.3.2) в концентрации 0,1 мкг/мл. В другую камеру, выбранную в качестве опорной, вносят 0,02 мкл исследуемой пробы. Смесь перемешивают при 25^оС магнитной мешалкой, создают в камерах стоячую волну и определяют разность скоростей акустических колебаний между первой и десятой минутами реакции.

Операции повторяют при различных концентрациях креатина в диапазоне 1,5x x10^-5-9,6 ˙ 10^-4 М и строят калибровочную кривую. Результаты измерений представлены в табл. 3.

Как видно из таблицы предел обнаружения креатина по скорости ультразвука составляет 1,5 ˙ 10^-5 М, а погрешность измерения контрольной пробы 1,7% .

П р и м е р 4. Для определения крахмала в биологических пробах в две идентичные акустические ячейки вносят по 0,65 мл исследуемой пробы. Затем в одну из камер, выбранную в качестве рабочей, вносят 0,02 мл раствора глюкоамилазы (3,2.1.3) в концентрации 2 мкг/мл. В другую камеру, выбранную в качестве опорной, вносят 0,02 мкл исследуемой пробы. Смесь перемешивают при 25^оС магнитной мешалкой, создают в камерах стоячую волну и определяют разность скоростей акустических колебаний между первой и десятой минутами реакции.

Операции повторяют при использовании различных концентраций крахмала в диапазоне концентраций 3 мкг/мл - 96 мкг/мл и строят калибровочную кривую. Результаты измерений представлены в табл. 4.

Как видно из табл. 4 предел обнаружения крахмала по скорости ультразвука составляет 3 мкг/мл, а погрешность измерения контрольной пробы 2,2% .

Как видно из выше приведенных примеров предлагаемый способ позволяет повысить чувствительность измерений в 40-60 раз, повысить точность измерений в 8-9 раз и сократить длительность анализа до 10 мин. (56) Kremkau F. W. , Cowgill R. W. Biomolecular absorption of ultrasound. J. Acoust. Soc. Am. 1984, 76 (5), 1330-1335.

Использование: в области энзимологии и может найти применение в физико-химической биологии, биотехнологии и медицине для определения активности ферментов или количества субстрата. Изобретение позволяет повысить чувствительность и точность измерений и сократить продолжительность за счет того, что регистрируют изменения скорости распространения акустических колебаний в инкубационной смеси ферментов с раствором специфического субстрата. При этом инкубацию проводят непосредственно в акустической камере, в качестве которой используют акустический резонатор, а для определения изменений скорости распространения акустических колебаний в инкубационной смеси создают стоячую волну и регистрируют изменения собственной частоты акустического резонатора. 1 з. п. ф-лы, 4 табл.

1. СПОСОБ АКУСТИЧЕСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТА ИЛИ КОЛИЧЕСТВА СУБСТРАТА В МИКРООБЪЕМАХ путем инкубации фермента с раствором субстрата и регистрации изменений акустических свойств реакционной смеси при ферментативной реакции, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности и точности способа и сокрашения его длительности, определяют изменение скорости распространения акустических колебаний в реакционной смеси, а изменение акустических свойств реакционной смеси при ферментативной реакции устанавливают по изменению скорости распространения акустических колебаний в реакционной смеси, при этом инкубацию фермента с раствором субстрата проводят непосредственно в акустической камере. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве акустической камеры используют акустический резонатор, а для определения изменений скорости распространения акустических колебаний создают в камере с исследуемой средой стоячую волну и регистрируют изменения собстренной частоты данного резонатора.