Изобретение относится к генетической инженерии, в частности к рекомбинантным ДНК, содержащим последовательность, кодирующую человеческий проаполипопротеин A-I, используемый для трансформации штаммов-реципиентов, способных продуцировать человеческий проаполипопротеин A-I.
Человеческий аполипопротеин A-I (апо A-I) является основным белковым составляющим липопротеинов высокой плотности (LНД) и хиломикронов лимфы. Печень и тонкая кишка являются основными центрами синтеза апо A-I. Апо A-I синтезируется в этих органах в форме белкового предшественника (препроапо A-I). Расщепление препептида происходит внутри клетки и проапо A-I секретируется в плазме и в лимфе.
Проапо A-I содержит шесть дополнительных аминокислот (Arg - His - Phe - Trp - Gln - Gln), которые присоединяются к концевой аминогруппе апо A-I. Достигнув области расположения сосудов, проапо A-I расщепляется в условиях "ин виво" специфическим протеолитическим ферментом (апо A-I протептидаза), образуя зрелый апо A-I.
Этот зрелый апо A-I представляет собой уникальный негликозилированный полипептид известной последовательности, состоящий из 243 аминокислот. Он служит в качестве кофактора для плазматического фермента лецитина: холестеролацилтрансферазы, которая ответственна за образование в плазме большинства сложных эфиров холестерина. Дефекты в структуре или биосинтезе аполипопротеина могут привести к нарушению в системе переноса плазматических липидов и к развитию заболевания коронарных артерий. Показано, что низкие плазматические концентрации апо A-I и LНД составляют значительный фактор риска для сердечных припадков (инфаркт миокарда) и для других заболеваний, связанных с атеросклерозом сосудов. В частности, мутации в гене, кодирующем апо A-I, связаны со снижением концентрации LНД, а также с преждевременными заболеваниями коронарных артерий.
Апо A-I и LНД являются основными составляющими плазмы, которые участвуют в переносе холестерина периферических тканей (артерий) к печени (называемый также обратным переносом холестерина), экстретируясь организмом. Принимая во внимание то, что накопление холестерина в артериях является наиболее важной особенностью и механизмом атеросклероза, стимуляция обратного переноса холестерина посредством апо A-I может замедлить и преобразовать атеросклеротический процесс и, тем самым, снизить случаи сердечных припадков.
Созревание проапо A-I в апо A-I может осуществляться вне клетки по мере нахождения в крови в течение менее 12 ч. Принимая во внимание то, что проапо A-I является основным, если не единственным, предшественником зрелого апо A-I, он может быть использован в заместительной терапии каждый раз, когда снижается концентрация LНД, например, при наследственных или приобретенных пороках.
Известен способ получения апо A-I в клетках E. coli в форме белка, слитого с нерасщепляемой бета-галактозидазой. Попытки получить зрелый апо A-I в форме неслитого белка остались безуспешными [1] .
Известна также экспрессия белка, подобного человеческому аполипопротеину A-I в E. coli, который трансформируется плазмидой рHAIE-I, содеpжащей ген со структурой апо A-I, под контролем промотора tac. Однако данный структурный ген является неполным и состоит из кодонов аминокислот от +4 до +243, которым предшествует кодон ATG инициирования трансляции. Это приводит к тому, что полученный продукт экспрессии содержит N-терминальный метионин (соответствующий кодону ATG), который может вызвать побочные эффекты при его использовании в терапии.
Описана экспрессия человеческого аполипопротеина A-I в клетках яичника китайского хомяка (культура животных клеток). Эти китайские клетки хомяков трансформируют форму проапо в зрелую форму апо, поскольку лишь 5-10% секретированного белка апо A-I представляет собой белок проапо A-I, остальную часть составляет зрелый белок апо A-I. Продуктивность системы относительно низка, поскольку 0,5х106 клеток секретиpуют лишь 25-30 мкг/мл апо A-I в течение 24 ч [3] .
Настоящее изобретение касается способа получения человеческого проаполипопротеина A-I методами рекомбинантной ДНК, т. е. зрелого белка проапо A-I, который способен расщепляться специфическим протеолитическим ферментом пропептидазой апо A-I. Под понятием "зрелый", используемым в данном контексте, имеется в виду не только человеческий проапо A-I как таковой, то также и соответствующий белок, первая аминокислота которого представляет собой метионин.
Описано построение векторов колонирования и экспрессии, содержащих последовательность ДНК, кодирующую человеческий проапо A-I, что обеспечивает амплификацию и последующую экспрессию зрелого человеческого белка проапо A-I, а также мет-проапо A-I. Далее изобретение касается культур клеток или генетически модифицированных микроорганизмов, экспрессирующих полипептид проапо A-I.
В материалах раскрыто получение зрелого человеческого проапо A-I, который может быть превращен в условиях ин витро или ин виво в зрелый человеческий апо A-I путем протеолитического действия апо A-I пропептидазы. Человеческий проапо A-I используют для терапевтических целей, может быть использован также мет-проапо A-I, если присутствие метионинового радикала фармацевтически приемлемо, поскольку данный продукт может быть естественным образом превращен в зрелый аутентный человеческий апо A-I в токе циркулирующей крови. Человеческий проапо A-I получают в отобранных микроорганизмах или клеточных культурах, которые способны воздействовать на N-терминальный метионин и, тем самым, способны продуцировать человеческий проапо A-I в такой форме, которая не содержит N-терминального метионина. Альтернативно, человеческий проапо A-I содержит он или не содержит N-терминальный метиониновый радикал, может быть расщеплен в условиях ин витро с образованием зрелого человеческого апо A-I. Это же относится к белкам слияния и белкам, включающим сигнальный N-терминал проапо А-I; расщепление этого продукта приводит к образованию аутентного человеческого апо A-I, лишенного N-терминального метионина. Изобретение касается модифицированной последовательности, кодирующей по меньшей мере часть молекулы человеческого пропапо A-I; такая модифицированная кодирующая последовательность улучшает эффективность трансляции ввиду снижения или даже предотвращения образования булавочных структур. Эффективную экспрессию обеспечивает модификация некоторых кодонов в последовательности, кодирующей аминокислоты от -6 до +14 человеческого проапо A-I. Эти модификации последовательности ДНК не оказывают никакого влияния на тип точки расщепления пропептидазы, ввиду того, что аминокислотная последовательность, распознаваемая пропептидазой, сохраняется в данном построении.
Настоящее изобретение касается последовательности рекомбинантной ДНК, включающей последовательность, кодирующую человеческий проаполипопротеин A-I, в которой часть естественной кодирующей последовательности заменена фрагментом ДНК, кодирующим те же аминокислоты, но состоящим из другой последовательности нуклеотидов, таким образом, что снижается или предотвращается образование булавочных структур. Последовательность, кодирующая аминокислоты от -6 до +14 проапо A-I, заменяется последовательностью:
5'-ATGAGACATTTCTGGCAGCAGGACGAACCTCCACAATCTCCTTGGGATAGAGTTAAGGA - CTTG-3', которая включает дополнительный ATG кодон инициирования трансляции и модифицированные кодоны аминокислотных групп -6, -1, +1, +3, +4, +5, +6, +7, +10, +11 и +14.
Осуществлено клонирование последовательности ДНК в векторы, в результате получены рекомбинантные плазмидные ДНК pUL B9291, pUL B9292, pUL B9296, pUL B9299, pNiV 1612 и pNiV 1613. Плазмиды pUL B9291 и pUL B9292 содержат ген с модифицированной структурой проапо A-I, которому предшествует кодон ATG, и который находится под контролем промотора pL фага лямбда. Эти плазмиды представляют собой векторы экспрессии, которые пригодны для экспрессии белка в клетках E. coli, который может быть расщеплен пропептидазой с образованием зрелого аутентного человеческого апо A-I. При трансформации в клетки E. coli плазмида pUL В9296 обеспечивает экспрессию слитого белка, содержащего бета-галактозидазу и человеческий проапо A-I, под контролем зоны стимулятора lac E. coli. Если учесть то, что данный продукт слияния содержит еще последовательность расщепления пропептидазы, то он может быть расщеплен с образованием зрелого человеческого апо A-I.
Плазмида pUL B9299 представляет собой вектор, обеспечивающий экспрессию белка в дрожжах и содержащий зону промотора и терминатора транскрипции AR G3. Полученный человеческий проапо A-I может быть снова расщеплен пропептидазой с образованием аутентного зрелого человеческого апо A-I.
Плазмиды pNiV 1612 содержит ген со структурой проапо A-I, слитый с последовательностью ДНК сигнального пептида белка OmpA E. coli и под контролем промотора lpp (липопротеина) и промотора-оператора lac. В данном случае последовательность, кодирующая сигнальный пептид OmpA, предшествует последовательности проапо A-I без ATG кодона инициирования трансляции. Эта плазмида представляет собой вектор секреции и он направляет синтез человеческого проапо A-I, который может быть секретирован в периплазму без N-терминального метионина в E. coli. Плазмида pNiV 1613 представляет собой вектор, который обеспечивает встраивание последовательности ДНК человеческого проапо A-I в бакуловирус. Она включает полигедриновый промотор бакуловируса и ген со структурой проапо A-I, включая ATG кодон инициирования трансляции.
Совместно с естественным источником бакуловируса (вирус ядерного полигедрозиса Autographa cahfornica, AcNPV), плазмида pNiV 1613 обеспечивает синтез проапо A-I в клетках насекомых и может снова освобождаться от метионина после посттрансляционных модификаций в клетках насекомых.
Описано использование штамма ММ 294 микроорганизма E. coli K12 (endo A thi , hsdR, SupE); этот штамм был сдан на хранение в Коллекцию культур американского типа (АТСС N 33625).
Векторы экспрессии бакуловируса, например, pAcR P6 и pAcYMI и бакуловирус дикого типа (вирус ядерного полигедрозиса Autographa californica, AcNPV) широко используют в настоящее время.
В качестве реципиента используют также различные клетки насекомых для совместных векторов экспрессии, например, клетки Spodoptera frugiperda Sfg. Могут быть использованы различные штаммы дрожжей, заключающие в себя совместные векторы экспрессии, такие как плазмида YRp7, которая способна к отбору и репликации одновременно в E. coli и в дрожжах, в частности, Saceharomyces cerevisiae.
Штаммы дрожжей, которые могут быть использованы: штамм R Н218, депонированный в Коллекции культур американского типа без ограничения (АТСС N 44076); штамм 10 S 44с, который имеет генотип leu 2-3, leu 2-112, pep 4-3 и штамм 1 с 1697 d (arg j, leu 2-1) брадитрофный для аргинина (АТСС N 20631).
Сущность изобретения состоит в следующем.
Получают рибонуклеиновые кислоты. Препарат общей рибонуклеиновой кислоты (РНК) пропускают через колонку с олиго(dT)-целлюлозой и выделяют общие поли А+РНК. Из 10 г (человеческой печени получают 200 мкг А+РНК.
Реакцию обратной транскрипции осуществляют с использованием в качестве исходного продукта 0,1-5 мкг поли А+РНК, с помощью олиго (dT)12-18. Затем эту однонитевую ДНКс превращают в молекулу с двойной нитью (ДНК с db) с использованием обратной транскриптазы в качестве фермента. Препараты ДНКcdb, обычно в количестве 1 мкг, обрабатывают S1 нуклеазой с образованием явных концов. Затем ДНКсdb удлиняют с помощью олиго(dC). Обрабатывают 100 нг ДНКcdb ферментом терминальной деоксинуклеотидилтрансферазой.
Удлиняют ДНКcdb, присоединив 15 оснований их к 3' концам.
ДНК плазмиды pBR 322 обрабатывают PstI и удлиняют.
Удлиненные олиго (dC) ДНКcdb смешивают в равномолярных пропорциях с ДНК плазмиды pBR 322 с олиго(dG) концами.
Полученными гибридными ДНК трансформируют штамм ММ294 E. coli, отбирают несколько сотен трансформантов в среде тетрациклина, стойкость в этому антибиотику обеспечивается наличием плазмиды pBR 322. Трансформанты испытывают на чувствительность к ампициллину. Те из них, которые проявляют чувствительность, содержат химерную плазмиду, поскольку вставка чужеродной ДНК в вектор инактивирует ген ампициллина.
Трансформанты E. coli отбирают с помощью синтезированных олигонуклеотидов, меченных у конца 5' изотопом 32р, соответствующих фрагменту гена апо A-I.
Нуклеотидная последовательность человеческого апо A-I известна.
Осуществляют химический синтез фрагмента олигонуклеотидов длиной, соответствующей 22 основаниям, соответствующих 5' концу гена. Отобранная последовательность представляет собой:
5'-GCTGCGGTGCTGACCTTGGCCG-3'.
Синтезированный олигонуклеотид фосфорилируют у его 5' конца полинуклеотидкиназой Т4 и (гамма-32р)аденозинтрифосфатом (АТФ).
Синтезированные 30-мерные и 18-мерные фрагменты фосфорилируют у их 5' концов посредством полинуклеотидкиназы Т4. 1 мкг каждого олигонуклеотида, включая нефосфорилированные 35-мер и 43-мер, гибридизируют в течение 3 мин при 95оС в 300 ммоль ацетата натрия (рН = 7,0), затем медленно охлаждают при 4оС. Смесь гибридизации используют для построения векторов экспрессии.
Скопления клеток, имеющих оптическую плотность в пределах от 1 до 630 нм, получают в процессе культивирования штаммов, несущих плазмиды экспрессии человеческого проапо A-I, pUL В9291, pUL B9292, pUL B9296 и pUL В9299 (трансформированы соответственно в штаммах AR 58 и JN101 E. coli и в штамме 10S 44 с дрожжей). Образцы переводят в суспензию в 50 ммол трис-HCl буфере, рН 6,8, содержащую 2% додецилсульфата натрия (DSS), 6 мол. мочевины, 10% глицерина и 5% 2-меркаптоэтанола. Этот буферный раствор нагревают при кипении в течение трех минут. Образцы подвергают электрофорезу на полиакриламидных гелях. Общие белки обнаруживают путем окрашивания синим Комассье, и синтезированный человеческий проапо A-I идентифицируют путем иммунологического распознавания после электрофоретического переноса.
П р и м е р 1. Отбирают несколько сотен трансформантов, получаемых при клонировании ДНКcdb, соответствующей поли А+РНК человеческой печенки, в сайт PstI плазмиды pBR 322. Один из клонов дает интенсивный сигнал гибридизации в ходе данного эксперимента. Выделяют клон, обозначенный puL B1609, и вставку ДНК, присутствующую в рекомбинантной плазмиде, исследуют путем анализа последовательности данной ДНК. Ее длина соответствует 878 парам оснований (п. н. ); она кодирует полный полипептид препроапо A-I. Данный клонированный фрагмент ДНКс несет некодирующие зоны в 5' и 3' положениях (19 п. н. и 55 п. н. соответственно), последовательность на 54 п. н. кодирующую пептидный предшественник (от аа-24 до аа-7), последовательность на 18 п. н. кодирующую пропептид (от аа-6 до аа-1), и последовательность на 732 п. н. , кодирующую зрелый апо A-I (от аа+1 до аа-243), и включает кодон завершения трансляции.
П р и м е р 2. Строят плазмиду pUL В9291, продуцирующую человеческий проапо А-I путем расположения сегмента, происходящего от клона pUL В1609, за регулярным промотором лямбда PL. Построение этой плазмиды экспрессии требует синтеза фрагментов ДНК, включающих ограничительную точку NcoI, ATG кодон инициирования трансляции и последовательность нуклеотидов, кодирующую аминокислоты от аминированного конца гена со структурой человеческого проапо A-I, до первой уникальной ограничительной точки BalI.
Такой адаптер синтезируют химическими методами. Получают четыре олигонуклеотида; после гибридизации они кодируют метионин, соответствующий ATG кодону инициирования трансляции, для шести аминокислот, соответствующих пропептиду, и для 14 первых аминокислот зрелого человеческого апо A-I. Этот синтезированный адаптер служит для снижения до минимума образования вторичных структур у конца 5' гена. Для этого кодоны, отобранные для кодирования аминокислотных групп -6, -1, 1, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 11 и 14, не соответствуют естественным кодонам, имеющимся к ДНКс клона pUL В 1609.
Описанный выше синтезированный адаптер используют для присоединения фрагмента ДНК на 744 п. н. , происходящего от pUL B1609, к промотору лямбд PL в плазмиде экспрессии pUL B1221.
Примерно 0,1 мкг синтезированных фрагментов сшивают с помощью ДНК лигазы Т4 с 1 мкг фрагмента Bal1 - Pst1 на 744 п. н. , происходящего от pUL B1609, и с 1 мкг плазмидного вектора pUL В1221, отсеченного NcoI и BalI. До осуществления операции сшивки фрагмент BalI - PstI размером 744 п. н. обрабатывают ДНК полимеразой Т4 таким образом, чтобы происходило преобразование концов в положении 3' в свободные концы.
После амилификации в клетках штамма AR 58 E. coli перестроенные плазмиды исследуют путем анализа сайтов рестрикции и анализа последовательности ДНК синтезированных фрагментов и точек соединения. Рекомбинантная плазмида pUL В 9291 отвечает всем критериям, поскольку она имеет фрагменты в правильной ориентации и в правильном порядке.
П р и м е р 3. Последовательность ДНК, кодирующую человеческий проапо A-I, сливают в фазе правильного считывания ниже последовательности ДНК бета-галактозидазы. Ген бета-галактозидазы присутствует в плазмиде экспрессии E. coli pUR 288, которая несет эффективно индуцируемый промотор lac и соответствующие сайты рестрикции в последовательности бета-галактозидазы. Прежде всего ДНК плазмиды размером PUR 288 обрабатывают BamHI, затем ДНК полимеразой Т4 и гидролизуют Sal I. Выделяют фрагмент ДНК размером 805 п. н. из pUL B9291 последовательно путем обработки KpnI, обработки полимеразой Т4 и окончательного гидролиза SalI. Эти два фрагмента сшивают друг с другом в молярных пропорциях посредством ДНК лигазы Т4, и полученную плазмиду используют для трансформации компетентных клеток штамма IM101 E. coli, который является широко распространенным и легко доступным штаммом (АТСС N 33876). Трансформанты исследуют путем анализа рестриктазой на правильную ориентацию последовательности человеческого проапо A-I по отношению к гену бета-галактозидазы и на присутствие сайта Bam HI на стыке двух последовательностей. Это показывает, что последовательность человеческого проапо A-I хорошо слита ниже последовательности ДНК бета-галактозидазы и в фазе правильного считывания. Один из трансформантов, содержащий плазмиду pUL В9296, отвечает всем критериям.
П р и м е р 4. Последовательность к ДНК, кодирующую человеческий проапо A-I, клонируют между промотором и терминатором, которые несет плазмида экспрессии дрожжей. Для настоящего эксперимента выбирают вектор pRIT 10774. Вектор pRIТ 10774 реплицируется в E. coli и в дрожжах и несет промотор и терминатор транскрипции орнитинкарбамоилтрансферазы (ARG3), разделенные уникальным сайтом рестрикции Bam HI, приемлемым для вставки чужеродной ДНК, имеющей свой собственный ATG кодон инициирования трансляции. Кроме того, данный вектор несет последовательности 2 μ дрожжей, маркеры для отбора в дрожжах и маркер отбора AmpA для челночного вектора в E. coli. ДНК плазмиды pRIT 10774 обрабатывают Bam HI и ДНК полимеразой Т4.
Фрагмент ДНК на 810 п. н. отделяют от pUL В9291 путем гидролиза Asp 718 и SalI с последующей обработкой ДНК полимеразой Т4. Этот фрагмент кодирует человеческий проапо A-I и включает ATG кодон инициирования трансляции. Эти два фрагмента сшивают друг с другом в равномолярных пропорциях посредством ДНК лигазы Т4 и данную смесь используют для трансформации компетентных клеток E. coli ММ294. Контроль за трансформантами осуществляют путем рестриктного анализа, позволяющего проверить правильную ориентацию последовательности ДНК человеческого проапо A-I по отношению к последовательности промотора ARG3. Один из трансформантов содержит рекомбинантную плазмиду pUL В9299. Плазмиду pUL В9299 амплифицируют в E. coli и используют для трансформации сферопластов дрожжей Saccharomyces cerevisiae, штамма IOS44c.
Использование штамма Ic 1697d (АТСС N 20631) приводит к качественно аналогич-ным результатам. Затем трансформанты дрожжей подвергают испытанию на выражение человеческого проапо A-I.
П р и м е р 5. Последовательность ДНК, кодирующую человеческий проапо A-I, сливают в фазе правильного считывания с последовательностью ДНК сигнального пептида белка OmpA E. coli.
Этот вектор секреции несет сильный промотор lpp (липопротеин), фрагмент промотора-оператора lac, последовательность lac I репрессора lac и соответствующие ограничительные точки, расположенные непосредственно после последовательности, кодирующей сигнальный пептид гена OmpA. В первую очередь, вектор секреции pIN-III-ompA-2 гидролизуют EcoRI и обрабатывают ДНК полимеразой Т4. Затем фрагмент ДНК на 805 п. н. извлекают из pUL В9291 путем обработки рестриктазами Kpn I и Sal I и последующей обработки ДНК полимеразой Т4. Этот фрагмент кодирует человеческий проапо A-I и содержит ATG кодон инициирования трансляции. Оба фрагмента, полученные как описано выше, сшивают друг с другом в равномолярных пропорциях посредством ДНК лигазы Т4, и эту сшитую смесь используют для трансформации компетентных клеток штамма I A221 E. coli, культивированных в среде М9, содержащей 20 мг/л триптофана, 20 мг/л лейцина, 2 г/л лактозы и 50 мг/л ампициллина. Эти трансформанты отбирают на их стойкость к ампициллину и подвергают отборочному просеву с 18-мерным синтезированным олигонуклеотидом.
Отобранные трансформанты подвергают исследованию рестриктным анализом для проверки правильной ориентации последовательности ДНК проапо A-I относительно последовательности сигнального пептида, носителем которого является вектор секреции (сайт EcoRI на стыке двух последовательностей). Один из трансформантов несет рекомбинантную плазмиду, которая отвечает данному условию.
Лишнюю последовательность, происходящую от слияния с адаптором, подчеркнутую в приведенной ниже нуклеотидной последовательности:
5' GTA GCG GAG GCC GCT GAA TTC ATG AGA CAT TTC TGG 3'
Val Ala Gln Ala Ala Glu Phe Met Arg His Phe Trp устраняют посредством направленного мутагенеза. С этой целью осуществляют синтез нижеследующего 24-мерного олигонуклеотида: сигнальный петид <<------- проапо A-i 5' GTA GCG GAG GCC AGA CAT TTC TGG 3'
Val Ala Gln Ala Arg His Phe Trp лишенного 12 излишних оснований, и его используют для удаления лишней последовательности из 12 оснований, происходящей от адаптера.
Данный способ обеспечивает высокий выход продукта и наиболее высокую эффективность из числа существующих способов, вплоть до 95% .
В первую очередь, область ДНК, которую подвеpгают мутагенезу, клонируют в вектор М13. С этой целью фрагмент ДНК XbaI - BalI рекомбинантной плазмиды pIN - III - om рА-2, несущий ген проапо A-I, встраивают в сектор M13m p19, обработанный XbaI и Hind II. Затем мутагенный 24-мерный олигонуклеотид гибридизируют с одноцепочечным матриксом и удлиняют с помощью фрагмента Кленова ДНК полимеразы в присутствии ДНК лигазы Т4 для получения мутантного гетеродуплекса.
Избирательное удаление немутантной нити возможно за счет ввода тионуклеотида в мутантную нить в ходе синтеза в условиях ин витро и за счет расщепления нити NCiI, не подвергнутой фосфориотионатированию. Такие расщепления дают точки для экзонуклеазы III, которая разрушает нить, не являющуюся мутантом. В таком случае нить, являющаяся мутантом, используется как матрица для перестройки круговой молекулы с двойной нитью, приводящий к образованию гомодуплексной мутантной молекулы. Такой мутагенез подтверждает последовательность соединения между сигнальным пептидом и началом гена проапо A-I. Данную рекомбинантную плазмиду pNIV 1612 перестраивают путем сливки фрагмента XbaI - Hind III вектора pIN - III - ompA-2 с фрагментом XbaI - BalI, который лишен 12 излишних оснований, и с фрагментом BalI - Hind III гена проапо A-I.
Эти три фрагмента сшивают ДНК лигазой Т4 и данную смесь используют для трансформации компетентных клеток E. coli J А221. Эти трансформанты отбирают по их стойкости к ампициллину и с 18-мерным олигонуклеотидом. Один из трансформантов несет рекомбинантную плазмиду pNIV1612. В данном конечном построении последовательность, кодирующая сигнальный пептид ompA, предшествует полной последовательности проапо A-I без кодона ATG.
Трансформанты E. coli подвергают испытанию на экспрессию человеческого проапо A-I.
П р и м е р 6. Плазмиду pNIV1613, несущую последовательность ДНК человеческого проапо A-I, строят путем расположения сегмента, происходящего от клона pUL В9291, ниже промотора гена полигедрина бакуловируса. Данная плазмида несет промотор гена полигедрина вплоть до нуклеотида-7 в ведущей последовательности в положении 5', в ней отсутствует ATG кодон полигедрина и 170 первых нуклеотидов последовательности, кодирующей полигедрин. Соответствующий сайт BamHI расположен ниже нуклеотида-7. ДНК плазмиды pAcR Р6 обрабатывают BamHI. Фрагмент ДНК на 810 п. н. извлекают из pUL В9291 путем гидролиза с ограничительными фрагментами Asp718 и SalI. Данный фрагмент кодирует человеческий проапо A-I и содержит кодон ATG инициирования трансляции. Эти два фрагмента в равномолярных пропорциях обрабатывают ДНК полимеразой Т4 и сшивают с помощью лигазы Т4 и используют для трансформации компетентных клеток штамма AR 58 E. coli. Данные трансформанты отбирают на их стойкость к ампициллину с помощью 35-мерного синтезированного олигонуклеотида, меченного 32р, соответствующего части ДНК последовательности проапо A-I, и исследуют с помощью рестриктного анализа для проверки правильной ориентации данной последовательности ДНК проапо A-I относительно промотора гена полигедрина. Один из трансформантов несет рекомбинантную плазмиду pNIV1613.
П р и м е р 7. Культуры, состоящие из 20 мл штамма AR 58 или J М101 E. coli, трансформированные соответственно puL B9291 и pUL B9296, культивируют в обогащенной среде, дополненной 50 мкг/мл ампициллина, до тех пор, пока не достигается оптическая плотность от 0,6 до 630 нм. В случае pUL B9291 индукцию промотора лямбда PL осуществляют с созданием исходных условий роста культуры от 30 до 42оС таким образом, что происходит инактивация подавителя промотора лямбда PL. Индукция происходит в течение 20 мин.
В случае pUL B9296 индукцию промотора lac осуществляют с вводом в культуру, инкубированную при 37оС, химического индуктора IPTG (изопропил-бета-D-тиогалактозид) до тех, пока не достигается конечная концентрация 1 ммол. Индукция происходит в течение 60 мин.
С другой стороны, культуры, состоящие из 20 мл дрожжевых клеток 10S44 c, трансформированных pUL B9299, культивируют при 30оС в среде, дополненной глюкозой (1% ), до тех пор, пока не достигается оптическая плотность от 0,3 до 630 нм.
Отбирают образцы из 1 мл указанных выше культур и центрифугируют при 15000 g в течение пяти минут. Полученные осадки лизируют в кипящем додецилсульфате натрия (DSS). Эти скопления переводят в суспензию в 50 мкл буфера, содержащего DSS (50 ммол трис-НСl, рН 6,8, 2% DSS, 6 мол мочевины, 5 % 2-меркаптоэтанола и 10% глицерина), и данную суспензию нагревают при кипении в течение 3 мин при 100оС. Затем экстракты центрифугируют при 15000 g в течение 10 мин. Эти образцы готовы, таким образом, для анализа путем электрофореза на полиакриламидных гелях концентрацией 15 или 7,5% в присутствии DSS в денатурированных условиях.
После электрофореза полиакриламидные гели быстро промывают 40 мл дистиллированной воды и 40 мл буферного раствора фосфата натрия (50 ммоль) с величиной рН 7,5. Затем эти белки электрически переносят с гелей на нитроцеллюлозный лист в течение двух часов при 60 В и 1,5 А в том же буферном растворе фосфата. Нитроцеллюлозные листы насыщают альбумином (1% ) в 50 ммоль буферного раствора фосфата натрия с величиной рН 7,5, затем их инкубируют при комнатной температуре в течение ночи и в присутствии сыворотки кроличьего античеловеческого апо A-I при разбавлении 1/500 (и в случае pUL В9296 в присутствии моноклональных антител анти-бета-галактозидазы мыши) в том же буферном растворе, лишенном альбумина.
Данные листы пятикратно промывают 40 мл того же фосфатного буферного раствора и затем инкубируют в 40 мл фосфатного буферного раствора, содержащего 10 мкг/мл сыворотки козьего анти-антитела кролика (или анти-антитела мыши) и подвергают мечению в пероксидазе. После четырех часов инкубации при комнатной температуре данные листы снова пятикратно промывают в 40 мл фосфатного буферного раствора и окончательно выявляют путем ввода 50 мл раствора фромогенного субстрата (10 мг диаминобензидина, 100 мкл перекиси мочевины концентрацией 10% и 100 ммоль трис-НСl с величиной рН 7,6).
В случае pUL B9291 и pUL В9299 обнаруживают уникальный продукт, реагирующий с антителами анти-человеческого апо A-I. Этот продукт имеет молекулярный вес, соответствующий молекулярному весу эталонного естественного апо A-I. В случае pUL В9296 обнаруживают слитый полипептид бета-галактозидазы и проапо A-I (144 кДа), полипептид, реагирующий с сывороткой человеческого анти-апо A-I и с сывороткой анти-бета-галактозидазы. Эти размеры определяют предварительно с помощью калибровочной кривой, основанной на миграции эталонов молекулярного веса, находящихся на тех же гелях, что и клеточные экстракты.
В другом эксперименте культуры 20 мл слоя JA 221 E. coli, трансформированные pNIV1612, культивируют в обогащенной среде, дополненной 50 мкг/мл ампициллина, до тех пор, пока не достигается оптическая плотность, равная 0,6-630 нм. Индукцию промотора lac осуществляют путем ввода в культуру, инкубированную при 37оС, химического индуктора IPTG (изопропил-бета-тиогалактозид) до тех пор, пока конечная концентрация не будет равна 2 ммоль. Индукцию осуществляют в течение 60 мин. Отбирают образцы этих культур в количестве 1 мл и осуществляют центрифугирование при 15000 g в течение пяти минут. Полученные осадки собирают посредством небольшого осмотического воздействия с целью освобождения периплазмовой фракции. Освобожденная фракция переходит в суспензию в буферном растворе образца, содержащем DSS, упомянутый выше, но не содержащем мочевины, суспензию доводят до кипения, центрифугируют и подвергают электрофорезу на полиакриламидном геле концентрацией 12,5% в присутствии DSS, с последующим иммунодетектированием после электрофоретического переноса. Фракцию синтезированного проапо A-I обнаруживают в данной клетке, но не в периплазме. Это обусловлено либо тем фактом, что проапо A-I не секретируется, либо тем фактом, что эффективность осмотического воздействия не является оптимальной. Основную фракцию проапо A-I обнаруживают в свободном состоянии в данной среде после осмотического воздействия, указывая таким образом на то, что белок хорошо секретирован клетками.
П р и м е р 8. Рекомбинантную плазмиду pNIV1613 используют совместно с диким штаммом бакуловируса для совместного заражения клеток Spodoptera frugiperola в культуре. Выборка рекомбинантных вирусов, лишенных полигедрина, дала в результате рекомбинантные колонии. Рекомбинантный вирус, очищенный от колонии, используют для заражения клеток насекомых.
Этот рекомбинантный вирус испытывают на продуцирование проапо A-I иммунологическим способом после электрофоретического переноса и способом электрофореза на полиакриламидном геле концентрацией 12,5% в присутствии DSS после лизирования клеток посредством буферного раствора RIPA (0,05 мол буферный раствор трис-HCl, рН-7,2, содержащий 0,15 мол NaCl, 1% тритон Х100, 0,1% DSS, 0,1% дезоксихолята натрия и 1 ммол фтористого фенилметилсульфонила, FpMS) и обработки кипящим DSS. Обнаруживают один единственный продукт, реагирующий с антителами анти-человеческого апо A-I. Он имеет молекулярный вес, соответствующий молекулярному весу эталона естественного апо A-I, и этот выраженный белок является основным составляющим компонентом общих белков. Концентрация проапо A-I на литр культуры, измеренная путем простой радиальной иммунодиффузии, составляет примерно 100 мг.
П р и м е р 9. Для цитоплазматического продуцирования человеческого проапо A-I посредством E. coli в минимальной среде используют плазмиду pUL В9292. Плазмиду pUL В9292 строят путем обмена фрагмента Eco (R1 - Nco I плазмиды pUL B9291, кодирующей промотор лямбда PL, с тем же фрагментом Eco RI - NcoI плазмиды pOTS. Этот фрагмент Eco RI - Nco I вектора pOTS содержит также эффективный и регулируемый промотор, PL фага лямбда. Его выращивают в определенной минимальной среде культур 20 мл штамма AR 58 E. coli, трансформированного плазмидой pUL В9292. Состав минимальной среды (на литр) следующий: 3 г Na2HPO4 ˙ 2H2O, 3 г KH2PO4, 0,5 г NaCl, 1 г NH4CL, 1,37 ммол MgSO4 ˙ 7Н2О, 29,5 мкмол FeCl3 ˙ 6H2O, 236 мкмол MnSO4 ˙ H2O, 10 г глюкозы, 1 мг витамина В1, 50 мг ампициллина, питательный бульон культуры LB 1/20 (об/об). Клетки культивируют в данной минимальной среде до тех пор, пока оптическая плотность не достигнет значения 0,5-630 нм. Индукцию промотора лямбда PL осуществляют путем поддержания начальных условий роста культуры от 30 до 42оС так, чтобы инактивировать подавитель промотора лямбда PL. Индукцию осуществляют в течение 60 мин. Отбирают образцы культуры в количестве 1 мл и их пропускают в пресс Френча или центрифугируют при 15000 g в течение пяти минут. Полученный общий клеточный экстракт или осадок подвергают обработке DSS при кипении. После электрофореза и электрофоретического переноса обнаруживают один единственный продукт, который реагирует с антителами-анти-человеческой апо A-I. Молекулярный вес этого продукта соответствует молекулярному весу эталонного естественного апо A-I. Концентрация выраженного проаполипопротеина A-I в определенной минимальной среде составляет 13,5% общих белков, т. е. , установленная концентрация проапо A-I составляет примерно 270 мг на литр культуры.
П р и м е р 10. Осуществляют центрифугирование сырых экстрактов рекомбинантного проапо A-I при 4000 g в течение 15 мин и осадок извлекают. Поверхностный слой центрифугируют при 100000 g в течение двух часов. Полученный осадок переводят в суспензию в минимальном объеме буферного раствора (TE N100), содержащего 20 ммол трис-НСl, рН-7,5; 1 ммол этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЕДТА), 100 ммол NaCl; 1,75 мкг/мл FPMS и 100 мкг/мл мертиолата натрия (натриевая соль этил-ртуть-тиосалициловой кислоты), и указанные объемы суспензии и всплывшего слоя отдельно друг от друга доводят до начального объема экстракта посредством того же буферного раствора. Затем белок осаждают из обеих суспензий при увеличивающихся концентрациях изопропилового спирта. Методом радиальной иммунодиффузии, используя промышленный эталон апо A-I, определяют фракцию осажденного белка каждой суспензии, которая составляет основную часть иммунореактивности, соответствующую человеческому апо A-I. Полученную таким образом фракцию далее очищают методом хроматографии в колонке с Sephacrye S 200 с использованием того же буферного раствора в качестве элюента. Собирают фракции объемом 0,9 мл и методом радикальной иммунодиффузии в каждой фракции определяют количество общего белка, имеющего иммунореактивность, соответствующую иммунореактивности апо A-I. Молекулярный вес белка, элюированного в данных фракциях, определяют путем калибровки колонки с помощью эталонов с известным молекулярным весом, таких как альдолаза, альбумин бычьей сыворотки, яичный альбумин, химотрипсиноген и цитохром С, в идентичных условиях. Чистота проапо A-I на мг общего белка в основных фракциях, содержащих рекомбинантный проапо A-I, выраженная в мг белка, имеющего ту же иммунореактивность, что и промышленный эталон апо A-I, составляет 95% .
При центрифугировании при 100000 g рекомбинантного проапо A-I, очищенного и изолированного от поверхностного слоя и осадка, с изоэлектрической фокализацией и с применением аутогенерированного градиента с величиной рН от 4 до 6, получают одну единственную полосу с изоэлектрической точкой 4,95. Плазматический апо A-I является немного более кислотным и имеет изоэлектрическую точку 4,75. Это различие в величине рН, равное 0,2 между изоэлектрическими точками рекомбинантного проапо A-I и плазматического апо A-I, очень близко по значению уже известному различию между изоэлектрическими точками плазматического апо A-I и плазматического проапо A-I, которое, как уже сообщалось, равно 0,17.
Что касается молекулярного веса, то рекомбинантные проапо A-I осадка и поверхностного слоя оба состоят из одной единственной полипептидной цепи идентичного молекулярного веса, равного 29,9± 1,4 кДа. Человеческий плазматический апо A-I имеет несколько меньшую длину цепи и его молекулярный вес равен 29,3± 1,3 кДа.
Осуществляют химическое расщепление посредством 3-бром-8-метил-2-((2-нитрофенил)тио)-3Н-индола (BNPS-скатола). 5-10 мкг очищенных белковых препаратов растворяют в 100 мкл раствора фенола (0,15 об/об. % ) в водном растовре 50% (об/об) уксусной кислоты. Затем добавляют 50 мкл раствора 4,8 мг ВNPS-скатола на мл ледяной уксусной кислоты и инкубируют при 25оС в течение 72 ч. Затем добавляют 50 мкл 2-меркаптоэтанола и инкубируют второй раз в течение пяти часов при 87оС. Образцы выпаривают, снова растворяют в 100 мкл воды и трехкратно экстрагируют 200-ми мкл этилацетата. Органические фазы удаляют и водные фазы лиофилизируют и анализируют путем электрофореза на полиакриламидной геле-DSS.
В случае химического расщепления BNPS-сатолом, число и размер фрагментов, полученных от апо A-I, могут быть в той или иной степени предсказанными, если принять во внимание, что в используемых экспериментальных условиях BNPS-сатол избирательно отсекается после триптофановой группы. Приняв эффективность в каждой точке расщепления за 100% , наибольший фрагмент, который может быть получен, это С-терминальный фрагмент молекулярным весом 15,4 кДа. Молекулярные веса остальных фрагментов находятся в интервале от 0,5 до 5,8 кДа и ввиду этого они слишком малы для их обнаружения.
В случае неполного расщепления фрагмент 15,4 кДа будет "вытянутым" в направлении N-терминального конца, образующего соответственно фрагменты молекулярными весами 20,7 кДа, 23,1 кДа, 27,6 кДа. Такие предположения вполне реальны для человеческого плазматического апо A-I, так же как для других очищенных препаратов рекомбинантной проапо A-I. (56) 1. FEBS lett, 194, 1986, 343-346.
2. IP, N 96998/186, C 12 N 15/00, 1986.
3. J. B. Mallory et al. , J. Biol. Chem. , 1987.
Изобретение относится к генетической инженерии, в частности к рекомбинантным ДНК, содержащим последовательность, кодирующую человеческий проаполипопротеин А - 1, используемый для трансформации штаммов реципиентов и способных продуцировать человеческий проаполипопротеин А - 1. Получена последовательность рекомбинантной ДНК, включающая последовательность, в которой часть естественной кодирующей последовательности заменена фрагментом ДНК, кодирующим те же аминокислоты, но состоящим из другой последовательности нуклеотидов, таким образом, что снижается или предотвращается образование булавочных структур. Последовательность, кодирующая аминокислоты от -6 до + 14 проапо А - 1 заменяется последовательностью: 5′ - ATGAGACATTTCTGGCAGCAGGAACCTCCACAATCT CCTTGGGATAGAGTTAAGGACTTG - 3, которая включает дополнительный ATG кодон иницирования трансляции и модифицированные кодоны аминокислотных групп: С -1, +1, +3, +4, +5, +6, +7, +10, +11 и + 14.
ФРАГМЕНТ НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ, КОДИРУЮЩИЙ ЧЕЛОВЕЧЕСКИЙ ПРОАПОЛИПОПРОТЕИН А-1, полученный в результате объединения последовательности синтетической ДНК, кодирующей аминокислоты от -6 до +14 человеческого проаполипопротеина А - 1, и фрагмента природной ДНК, кодирующей аминокислоты от +15 до +243 проаполипопротеина А - 1, характеризующийся следующей нуклеотидной последовательностью:
-ATGAGACATTTCTGGCAGCAGGACGA
R H F W Q Q D E
-6 1
ACCTCCACAATCTCCTTGGGATAGAGT
P P Q S P W D R V
-6 10
TAAAGGACTTGGCCACTGTGTACGTGG
K D L A T V Y V
+14
ATGTGCTCAAAGACAGCGGCAGAGACT
D V L K D S G R D
20
ATGTGTCCCAGTTTGAAGGCTCCGCCT
Y V S Q F E G S A
30
TGGGAAAACAGCTAAACCTAAAGCTCC
L G K Q L N L K L
40
TTGACAACTGGGACAGCGTGACCTCCA
L D N W D S V T S
50
CCTTCAGCAAGCTGCGCGAACAGCTCG
T F S K L R E Q L
60
GCCCTGTGACCCAGGAGTTCTGGGATA
G P V T Q E F W D
70
ACCTGGAAAAGGAGACAGAGGGCCTGA
N L E K E T E G L
80
GGCAGGAGATGAGCAAGGATCTGGAGG
R Q E M S K D L E
90
AGGTGAAGGCCAAGGTGCAGCCCTACC
E V K A K V Q P Y
100
TGGACGACTTCCAGAAGAAGTGGCAGG
L D D F Q K K W Q
AGGAGATGGAGCTCTACCGCCAGAAGG
E E M E L Y R Q K
110
TGGAGCCGCTGCGCGCAGAGCTCCAAG
V E T L R A E L Q
120
AGGGCGCGCGCCAGAAGCTGCACGAGC
E G A R Q K L H E
130
TGCAAGAGAAGCTGAGCCCACTGGGCG
L Q E K L S P L G
140
AGGAGATGCGCGACCGCGCGCGCGCCC
E E M R D R A R A
150
ATGTGGACGCGCTGCGCACGCATCTGG
H V D A L R T H L
160
CCCCCTACAGCGACGHGCTGCGCCAGC
A P Y S D E L R Q
170
GCTTGGCCGCGCGCCTTGAGGCTCTCA
R L A A R L E A L
180
AGGAGAACGGCGGCGCCAGACTGGCCG
K E N G G A R L A
190
AGTACCACGCCAAGGCCACCGAGCATC
E Y H A K A T E H
TGHGCACGCTCAGCGAGAAGGCCAAGC
L S T L S E K A K
200
CCGCGCTCGAGGACCTCCGCCAAGGCC
P A L E D L R Q G
210
TGCTGCCCGTGCTGGAGAGCTTCAAGG
L L P V L E S F K
220
TCAGCTTCCTGAGCGCTCTCGAGGAGT
V S F L S A L E E
230
ACACTAAGAAGCTCAACACCCAGTGA
Y T K K L N T Q
240
