Способ получения последовательности ДНК, содержащей фрагмент, кодирующий человеческий проаполипопротеин А-1 Советский патент 1993 года по МПК C12N15/12 

Изобретение касается способа получения новой последовательности дезоксири- бонуклеиновых кислот (ДНК), содержащей фрагмент, кодирующий человеческий про- аполипопротеин А-1.

Человеческий аполипопротеин А-1 (апо А-1) является основным белковым составляющим липопротеинов высокой плотности (LHD) и хиломикронов лимфы. Печень и тонкая кишка являются основными центрами синтеза апо А-1, Апо А-1 синтезируется в этих органах в форме белкового предшественника (препроапо А-1). Совместное трансляционное расщепление препептида происходит внутри клетки, и проапо А-1 сек- ретируется в плазме и в лимфе.

Проапо А-1 содержит шесть дополнительных аминокислот (Arg-HIs-Phe-Trp- Gln-GIn), которые присоединяются к концевой аминогруппе апо А-1. Достигнув

области расположения сосудов, проапо A--I расщепляется в условиях ин виво специфическим протеолитическим ферментом (апо А-1 пропептидаза), образуя зрелый апо А-1.

Этот зрелый апо А-1 представляет собой уникальный негликозилированный полипептид известный пос :едовательност и, состоящий из 243 аминокислот(Н.В. Brewer и др., Biochem Biophys. Res. Commun 80, 1978 г., с. 623-630); он служит в качестве кофактора для плазматического фермента лицитина:холестеролацилтранрсферазы. которая ответственна за образование в плазме большинства сложных эфиров холестерина. Дефекты в структуре или биосинтезе аполипопротеина могут привести к нарушению в системе переноса плазматических липидов и к развитию заболевания коронарных артерий. Показано, что низкие

(Л

С

оо

Сл

4 Ю

W

плазматические концентрации апо А-1 и LHD составляют значительный фактор риска для сердечных припадков (инфаркт миокарда) и для других заболеваний, связанных с атеросклерозом сосудов. В частности, мутации в гене, кодирующем апо А-1, связаны со снижением концентрации LHD, а также с преждевременными заболеваниями коронарных артерий. Апо А-1 и LHO являются основными составляющими плазмы, которые участвуют в переносе холестерина периферических тканей (артерий) к печени (называемый также обратным переносом холестерина), экстретируясь организмом.; Принимая во внимание то, что накопление холестерина в артериях является наиболее важной особенностью и механизмом атеросклероза, стимуляция обратного переноса холестерина посредством апо А-1 может замедлить и преобразовать атероскяеротмче- ский процесс и тем самым снизить случаи сердечных припадков.

Созревание проапо А-1 в апо АН может осуществляться количественно вне клетки по мере нахождения в кроем в течение менее 12 часов. Принимай во внимание то, что проапо A-I является основным, если не единственным, предшественником зрелого апо А-1, он может быть использован в заместительной терапии каждый раз, когда снижается концентрация LHO. например, при наследственных или приобретенных пороках. Ввиду терапевтической ц&иности зло А-1, исследователи делали попытки разработать способы, позволяющие продуцировать апо А-1 в больших количествах. Такие общеизвестные способы включают очистку апо А-t, полученного в кровяной плазме.

Из публикаций (P. Cheung и L. Char, Nucleic Adds Res., 11. 1983 г.. 3703-3715; JJ. Sellhamer и др., DMA, 3.1984 г., 309-317, и японская патентная заявка № 96998/86) известно, что комплементарная ДНК. кодирующая препроапо А-, может быть получена способами генетики.

Так, R. Lorenzettf и др. (FEBS tett 194, 1986 г., 343-346) показали, что апо может быть экспрессирован в Е. соИ в форме белка, слитого с нерасщепляемой бета-га- лэктозидазой. Однако попытки экслресси- ровать зрелый апо А-t в форме неслитого белка остались безуспешными. В японской патентной заявке № 96998/86 описывается экспрессия белка подобного человеческому аполипопротеину А-1, в Ј. cglL который трансформируется плазмидой рНА1Е-1, содержащей ген со структурой апо А-1, под контролем промотора |acv Однако данный структурный ген являете неполным и состоит из кодонов аминокислот от +4 до +243,

которым предшествует кодон АТС инициирования трансляции. Это приводит в результате к тому, что полученный продукт депрессии содержит N-терминальный мети- онин {соответствующий кодому ATG), который может вызвать побочные эффекты при его использовании в терапии.

Изобретение касается способа получения человеческого проаполипопротеина А- I, то есть зрелого белка проапо А-1, который способен расщепляться специфическим протеолитическим ферментом пропептида- зойапо А-1. Подпонятием зрелый, используемым в данном контексте, имеется в виде не только человеческий проапо А-1 как таковой, но также и соответствующий белок, первая аминокислота которого представляет собой метионин, и присутствие которого обусловлено АТС кодоном инициирования трансляции в построении вектора экспрессии.

Благодаря данному способу получения, человеческий проапо А- полностью освобожден от обычных эндогенных белков и других исходных материалов или продуктов.

Изобретение относится к способу получения последовательности ДНК, содержащей фрагмент, кодирующий человеческий проаполипопротеина А-1, предусматривая получение клонов ДНК путем клонирования двунитевой комплементарной ДНК р PBR322, выбор клона, кодирующего пре- проаполипопротеин А-1, выделение последовательности ДНК из выбранного клона и характеризуется тем, что в целях обеспечения наилучшей экспрессии человеческого проаполипопротеина А-1, при помощи ДНК

-лигазы Т4, связывают фрагмент Д Н К Bal 1

-P.stl. кодирующий аминокислота с +15 по 0 +243 препроаполипопротеина A-I, в конце

синтетического фрагмента, имеющего последовательность ДНК (указана одинарная цепочка):

5-ATGAGACATTTCTGGCAGCAGGACG AACCTCCACAATCTCCTTGGGATAGAGTTA AGGACTTG-3V

кодирующую аминокислоты с -б до +14 полипептида и содержащую кодон инициации трансляции и модифицированные кодоны для аминокислот -6, -1, +1, +3, +4, +5. +6, +7, +10, +11 и +14. Последовательность модифицированной ДНК, полученной, согласно способу настоящего изобретения, находит важное применение в конструировании вектора клонирования и экспрессии, содержащего эту последовательность ДНК, кодирующую человеческий проапо А-, что дает амплификацию, а, следовательно, экспрессию зрелого человеческого проапо A--I и мет-проапо А-}; его конъюгатов слияния

0

5

0

5

0

5

5

0

5

или его конъюгатов с N-концевым сигналом, культурами жизнеспособных клеток или генетически модифицированных микроорганизмов, содержащих такие векторы, и способных продуцировать полипептиды человеческого проапо А-1 в физическом состо- янии, отличном от того, который обнаруживают или выделяют из. источника или естественного окружения. Полученный человеческий проапо А-1 в значительной мере освобожден от обычных эндогенных белков и других исходных материалов и продуктов.

Белок, продуцируемый клетками или микроорганизмами, модифицированными последовательностью ДНК, полученной согласно способу настоящего изобретения, состоит из или содержит зрелый человеческий проапо А-1. который в таком случае может быть превращен в условиях hvyltro: или in vivo в зрелый человеческий ало А-1 путем протеолитического действия апо А-1 пропептидазы. Полученный человеческий проапо А-1 может быть использован как таковой в терапевтических целях; может быть использован мет-проэпо АН, если присутствие метионилового радикала фармацевтически приемлемо, т.к. данный продукт может быть естественным образом и эффективно превращен в ток циркулирующей крови натуральной пропептидазой, в аутентный зрелый человеческий апо А-1. При желании, человеческий проапо А-1 может быть продуцирован в отобранных микроорганизмах или клеточных культурах, которые способны воздействовать на N- концевой метионин, и, следовательно, способны продуцировать человеческий проапо А-1 в форме, не содержащей М-концевой метионин. Другими словами, человеческий лрозпо А-1 содержит или не содержит N- концевой метиониловый радикал, может быть расщеплен в условиях in vitro.с обра- зованием зрелого человеческого апо А-1, который может быть использован в терапевтических целях. Зто же относится и к конъюгатам слияния и коньюгатам, включающим сигнальный N-терминал проапо А- I; расщепление этого продукта приводит к образованию аутентного человеческого апо А-1, лишенного N-концевого метионина.

Установлено, что эффективная экспрессия может гарантироваться за счет соответствующей модификации некоторых кодонов в последовательности, кодирующей аминокислоты от -6 до +14 человеческого проапо A-I. Понятие соответствующая модификация в данном контексте означает, что некоторые естественные кодоны заменяются другими кодонами. которые, согласно гене0

5

0

тическому коду, представляют собой те же аминокислоты и. кроме того, это понятие означает, что все взятые совместно модификации приводят к снижению или даже к полному устранению образования булавочных структур. Следует подчеркнуть, что такие модификации последовательности ДНК не оказывают никакого влияния на тип точки расщепления -пропептидэзы ввиду того, что аминокислотная последовательность, распознаваемая пропептидазой,сохраняется в данном построении.

Продуцируемый белок, является продуктом культуры клеток или генетически модифицированного микроорганизма и может быть представлен в форме зрелого проапо A-I, в форме зрелого проапо А-1, которому предшествует радикал метионина, в форме слитого белка, такого как, например, бета- галактозидаза-проапо А-1, и в форме соединения препроапо А-1.

Культура клеток или микроорганизмов, используемые для данного продуцирования, не ограничиваются клеточными линия5 ми и специфическими организмами: могут использоваться как прокариотические клетки, так и эйкариотические клетки, включая линии клеток животных и человека. Лишь с целью иллюстрации ниже дается пример

0 экспрессии в бактерии § (кзк представителя прокариотических клеток) и в дрожжах Зассггагогтшсеа cerevisiae. а также в клетках насекомых, зараженных бакулови- русом (как представителей зйкаристическмх

5 клеток).

Реплицируемыми векторами клонирования и векторами экспрессии, содержащими последовательность ДНК. полученную согласно изобретению, и используемыми в примерах являются рекомбинэнтные плазмиды PULB9291.pul B9292.pu1 E9296, ри1 В9299, pN IY612 и pN IY1613. построение которых будет представлено ниже. Первые названные плазмиды, pu1 B9291 и ри1 В9292 содержат ген с модифицированной структурой проапо АН, которому предшествует кодон ATG, и который находится под контролем промотора Fh фага лямбда. Эти плазмиды представляют собой векторы экспрессии, которые пригодны для ЕЕ. соН и направляют синтез человеческого проапо А-1, который может быть расщеплен пропептидазой с образованием зрелого аутентного человеческого апо АН. При вводе s JL coj плазмида puL B9296 направляет экс- пресслитого белка, содержащего бета-га- лактозидазу и человеческий проапо А-, под контролем зоны стимулятора Jac. E. соП. Если учесть то, что данный продукт слияния содержит еще последовательность расщеп0

5

0

5

пения пропептидазы, то он может быть расщеплен с образованием аутентного зрелого человеческого ало A-I.

Плазмида puL В9299 представляет собой вектор экспрессии, пригодный для дрожжей и содержащий зоны промотора и терминатора транскрипции , позволяющий гарантировать эффективную экспрессию в дрожжах. Полученный человеческий проапо A-I может быть снова расщеплен пропептидазой с образованием аутентного зрелого человеческого ало А-К

Плазмида pN IY1612 содержит ген со структурой проапр A-I, слитый с последовательностью ДНК сигнального пептида белка . cpji и под контролем промотора Ipj) (лииопротеина) и промотора-оператора lac. В данном построении последовательность, кодирующая сигнальный пептид . предшествует последовательности проапо A-I без ATG кодона инициирования трансляции. Эта плазмида представляет собой вектор секреции подходящий для Е. cotl и направляет синтез человеческого проапо А- I, который может быть секретирован в периплазме без N-терминального метионина, Плззмида pN IY1613 представляет собой вектор переноса для ввода последовательности ДНКс человеческого проапо А-l в ба- куловирус. Она включает полигедриновый промотор бакуловируса и ген со структурой проапо АН, включая ATG кодон инициирования трансляции.

Совместно с естественным источником бакуловируса (вирус ядерного полигедрио- зисаА и|й9ЧЗр Ьа caUfornlca AcNPN), плазмида pNIY1613 направляет синтез проэпо А-1 «в клетках насекомых и может снова освобождаться от метионина после пост-транс- ляционных модификаций в клетках насекомых.

В зависимости от типа используемого вектора и от выбранного хозяина может использоваться любой прием генетики, пригодный для достижения желаемой генетической модификации, включая транс- фекцию, трзнедукцию и др.

Данное изобретение осуществляется со штаммом ММ 294 микроорганизма Е. соИ K12(endoj trji. Ш1В. ); этот штамм был сдан на хранение был сдан на хранение в Коллекцию культур американского типа (АТСС № 33625) без ограничения в отношении его доступности.

Тем не менее, могут быть использованы другие микробные штаммы, включающие известные штаммы Ј. еоН. такие как ЈлаэУ В, х 1776 (АТСС №31537. депонирован 3 июля 1979 года, без ограничения), J-.. соН.АД 58, производное от № 99 (АТСС №

й

33956) с C.III. cl 857, bio функции дельта Н, лишенные лямбда, поставляемый PL- PHARMACIA (YEMO++ и др., Prpc. Nntl. Acad Sci, США. 82, 1985 г., стр. 88-92; G Devare и

5 др., Cell, 36 1984 г., стр. 43-49), Е. col) t.M 101 (АТСС N° 33876)(l. Messing и др., Nucleis Acids Res 9,1981 г., стр. 309-321), или E.cgli J А221 ОРР-. hacM+. trp Е5, leu B6, lac Y, rec AI/F , lac f, Iac+, pro+) (J. Ghrayeb и др.,

10 EMBO J6 3. 1984 г., стр. 2437-2442), или другие микробные штаммы, многие из которых депонированы и доступны согласно положению о депонировании известных микроорганизмов, таких как микроорганиз15 мы культур американского типа (АТСС) - смотри перечни каталога АТСС. Эти микроорганизмы включают, например, BacllH, такие как Basillus sjjbtills и другие кишечные бактерии, из которых можно назвать, напри20 мер, Salmonella T pjiirrmjlun и Serratta marcelsaris с использованием плазмид, которые могут реплицироваться и выражать последовательности гетерологических ненов. Плазмиды экспрессии для применения

25 в отношении бактерий, например. Е. coii. обычно получаются из плазмиды pBR322, используемой в качестве вектора (депонирована в АТСС под номером 37017) и путем вставки соответствующим образом после30 довательности гетерологического гена одновременно с сигналами инициирования и завершения трансляции, в фазе считывания, точно соответствующей функциональному промотору, с преимущественным

35 отбором естественных или искусственно образованных ограничительных точек. Данный вектор будет являться носителем одного или нескольких характеристических генов отбора по фенотипу и источника ре40 пликации для обеспечения гарантии амплификации в хозяине. Эта гетерологическая вставка может быть снова экспрессирована таким образом, чтобы получить экспрессию одновременно с предыдущей слитой после- 45 довательностью, происходящей, например, от генов системы lac.

Эти векторы экспрессии бакуловируса, например pAcRPG и pAcYMI (J. Matsuura и другие. J, Gen. virol, 68, 1987 г., стр. 123350 1250) и .бакуловирус дикого типа (вирус ядерного полигедрозисэ Au toj raЈjha eallfornlca AcNPV) широко используются в настоящее время. Они подробно описаны в литературе и могут быть получены в основ55 ном согласно способу, используемому на Техасской экспериментальной сельскохозяйственной станции.

8 качестве хозяина можно использовать также различные клетки насекомых для совместимых векторов экспрессии, например клетки SBQdojJtera frugiperda Sf9(M.D. Summer и G.E. Smith, Справочное руководство по методам для векторов бакуловиру- сов и по обработке клеточных культур насекомых, Техасский Университет. Кол- ледж Стэшн, 1987 г., АТСС CRL 1711),

Могут быть использованы различные штаммы дрожжей, заключающие в себе совместимые векторы экспрессии, такие как плазмида YR p7 (D.T. Stinchcomb и др., Nature, 282, 1979, стр. 39-43), которая способна к отбору и репликации одновременно в Е. colj и в дрожжах, в частности, Saccharomyces с ere vis lag.

Штаммы дрожжей, которые могут быть использованы, представляют собой штамм РН218 (G. Miozzari и др.. J. Bacteriol, 134, 1978 г., стр. 49-59), депонированный в Коллекции культур американского типа без ограничения (АТСС № 44076), штамм 10544с (Т. Cabezon и др., Proc. Natl. Acad. Sci, США, 81, 1984 г., стр. 6594-6598), который имеет генотип jeu 2-3, jeu2-112. pep 4-3. (М. Hoylaerts и др., FEBS lett, 204,1986 г., стр. 83-87) и штамм 1с 1697 d (arg J, leu 2-4 брадитрофный для аргинина (АТСС № 20631).

Для экспрессии гетерологического гена, такого как ДНКс для человеческого про- апо A-I в дрожжах, необходимо построение плазмидного вектора, включающего четыре составляющих компонента. Первым составляющим компонентом является фрагмент, который обеспечивает трансформацию одновременно Е. coll и дрожжей, и который должен, следовательно, содержать ген отбора, происходящий от каждого организма. Это может быть ген, ответственный за стойкость к ампициллину, происходящий от JE. coli (см. Атра) и ген leu 2. происходящий от дрожжей. Этот составляющий компонент требует также источника репликации, происходящего от каждого организма, для того чтобы сохраняться как плазмидная ДНК в этих двух организмах. Это может быть ис- точник Е. coli. происходящий от pBR322 и источник arjsi хромосомы II дрожжей или источник репликации круговой ДНК 2 /и .

Вторым составляющим компонентом плазмиды является последовательность, расположенная в положении 5 сильно экс- прессированного гена дрожжей для осуществления транскрипции помещенного ниже структурного гена. Данная последовательность, расположенная в положении 5, мо- жет быть последовательностью, происходящей от генов ТОЩ или AJRG3 дрожжей. Этот фрагмент построен таким образом, что исключает структурные последовательности ТСЖЗ или ARG3., которые заменены последовательностью, содержащей альтернативные Ограничительные точки, например ограничительные точки Ncoj или В am HII для благоприятного связывания этой последовательности, расположенной в положении 5, со структурным геном.

Третьим составляющим компонентом системы является структурный ген, построенный таким образом, что содержит одновременно АТС сигнал инициирования трансляции и сигнал завершения трансляции.

Четвертым составляющим компонентом является ДНК последовательность дрожжей, содержащая последовательность, расположенную в положении 3 дрожжевого гена, которая заключает в себе соответствующие сигналы прекращения транскрипции и полиаденилирования. Так, например, плазмиды, направляющие продуцирование человеческого проапро А-l в дрожжах, могут быть построены путем вставки фрагментов гена полипептида человеческого проапро А-l в точку ВАтШ плазмиды выражения pRIT 10774, описанной в европейской патентной заявке Nfe 151102.

Дополнительные отличительные особенности настоящего изобретения будут ясны из последующего описания предпочтительных построений векторов, включающих последовательность ДНК, отвечающей данному изобретению, и условий, в которых эти векторы могут быть полезно использованы. Далее будет дана ссылка на рисунки, в которых:

На фиг. 1а и б показана последовательность нуклеотидов и аминокислот человеческого препроапо А-l. Последовательность нуклеотидов информационной РНК человеческого препроапо А-l определена, исходя из анализа ДНК последовательности ДНКс клона pULB1609. Аминокислоты, имеющиеся в сигнальном пептиде, в пропептиде и в полипептиде зрелого апо А-, идентичны и имеют нумерацию от первой аминокислотной группы белка апо A-I.

Подчеркнута область, соответствующая отобранной пробе синтетической ДНК, используемой для выделения данного клона. Буквенные аббревиатуры, используемые для обозначения аминокислот, имеют следующие значения: А. аланин; С, цистеин; D, аспаргиновая кислота; Е, глутаминовая кислота; F, фенилаланин; G, глицин; Н, гисти- дин; I, изолейцин; К, лизин; L, лейцин; М, метионин; N, аспарагин; Р. пролин; Q, глу- тамин: R, аргинин; S, серии; Т, треонин; V, валин: W, триптофан; и Y, тирозин.

На фиг. 2 представлена схема синтеза олигонуклеотидного адаптера для построения фрагмента ДНК, кодирующего 6 аминокислот пропептида и 14 первых аминокислот полипептида зрелого апо А-l с ATG кодоном инициирования. Стрелки показывают олигонуклеотиды, используемые для синтеза фрагмента Ncol BACI на 66/61 основных пар (вр.).

На фиг. 3 показано построение плазми- ды pUL B9291, которая несет регуляторные зоны лямбда PL и последовательность нук- леотидов проапо А-l; на фиг. 4 - построение плазмиды pUL B9296, которая несет промотор lac и Е. последовательность нукле- отидов бетагалактозидазы. слитой с последовательностью проапо А-l; на фиг. 5 - построение плазмиды pUL B9299, которая несет регуляторные зоны ABG3 дрожжей и последовательность нуклеотидов проапо А- I; на фиг. .6а,б,с - построение плазмиды pNIY1612, которая несет регуляторные зоны ас и Ipj), последовательность, кодирую- щую сигнальный пептид отр А. и последовательность нуклеотидов проапо А- I; на фиг. 7 - построение плазмиды PN1Y1613, которая заключает в себе регуля- торную зону гена полигедрина и последовательность нуклеотидов проапо А-К

Получение рибонуклеиновых кислот: Общая рибонуклеиновая кислота печени получается из хлористого соединения гуа- нидина (R.A. Сох, Методы в энзимологии, ХП, часть В, 1968 г., стр. 120-129). Данный препарат общей рибонуклеиновой кислоты (РНК) затем пропускается через колонку с олиго(оТ)-целл1Олозой для получения общих поли А РНК (Т. Manlatis и др., Молекулярное клонирование, Cold Spring Harba Laboratory Cold Spring Harbor, Нью-Йорк, 1982 г.). Из 10 граммов человеческой печени получается 200 мкг поли А РНК.

Синтез дополнительной ДНК (ДНКс) в условиях ин витро.

Реакции обратной транскрипции, с использованием в качестве исходного продукта 0,1-5 мкг поли А РНК осуществляются с участием олиго (dT)12-18 (примерно 1 мкг; источник: BOEHRINGER). Затем эта однони- точная ДНКс преобразуется в молекулу с двойной нитью (ДНКс db) с использованием той же обратной транскриптазы в качестве фермента. Препараты ДНКс db. обычно в количестве 1 мкг, обрабатываются St нукле- азой, с образованием явных концов. Эти процедуры хорошо известны для специалистов в данной области и подобно описаны Manfatls и др., указывалось выше. Затем ДНКс db вытягивается путем удлинения олиго (dC) согласно способу, описанному L.

Vllla-Komaroff и др. (Proc. Natl. Acad Sci, США, 75,1978 г., с. 3327-3731). Обычно осуществляется обработка 100 нг ДНКс db ферментомтерминальной

деоксинуклеотидилтрансферазой,

Обычно удлинения, соответствующие 15основаниям, присоединяются кЗ концам молекулы ДНКс db.

Клонирование вытянутой ДНКс db в

плазмидный вектор pBR 322.

ДНК плазмиды pBR 322 линейно выравнивается посредством фермента Pstl и вытягивается посредством удлинений олиго (dG) согласно способу, описанному R.M.

Lawn и др., (Nucleic Acids Res. 9.1981 г., стр. 6103-6114).

ДНКс db, вытянутые удлинениями олиго (dC), смешиваются в равномолекулярных пропорциях сДНК плазмиды pBR 322, вытянутой посредством олиго (dG).

Обычно для рециркуляризации плазмиды гибридизируются 50 мкг смеси. Эти условия хорошо известны для специалистов в данной области и подробно описываются в

работе R.M. Lawn и др., см. выше. Затем эта смесь гибридизации используется для трансформации компетентных клеток, например, штамма ММ294 Е. сой, согласно способу, описанному R.M. Lawn и др., см.

выше. Несколько сотен трансформант получается путем ростового отбора в среде тетрациклина, причем стойкость к этому антибиотику сообщается плазмидой pBR 322. Трансформанты были испытаны также

на их чувствительность к ампициллину. Те 4лз них. которые проявляли чувствительность, содержали химеровую плазмиду. поскольку вставка инородной ДНК в вектор инактивирует ген ампициллина.

Отборочный отсев банка ДНКс

Трансформанты Е..соИ отсеиваются посредством синтезированных олигонуклео- тидов, меченых у конца 5 изотопом 32Р, соответствующих фрагменту гена апо А-1.

Такая последовательность нуклеотидов человеческого апо A-t уже известна (см. Р. Chetng и L. Chan. см. выше, и J.J. Seilhamer и др., см. выше); таким образом, осуществ- ляют практически химический синтез по

способу N.D. Slnda и др. (Nucleic Acids. Res. 12. 1984 г.. стр. 4539-4557) фрагмента оли- гонуклеотидов длиной, соответствующий 22 основаниям, соответствующих 5 концу гена. Отобранная последовательность представляет собой:

5- GCTGCGGTGCTGACCTTGGCCG - 3. Перед использованием для гибридизации синтезированной олигонуклеотид фос- форилируется у его 5 конца

полинуклеотидокиназой Т4 (Р - L. Biochemicals и гамма-32Р аденозинтио- фосфатом. Условия мечения и гибридизации хорошо известны для специалистов в данной области и подробно описаны в работе Т, Manlatis и др., см. выше, а также в работе ВоПепА. идр.,(ОЫА,2,1983 г., стр. 255-264).

QЈHP° § i §L П йэ§мидь1 выраженш.

Способы получения ДНКдля выделения фрагментов ДНК, а также условия анализа посредством ограничительных ферментов и условия сшивки фрагментов хорошо известны для специалистов в данной области и подробно описаны в работе R.M. Lawn и др., см, выше, и в работе Т. Cabezon и др., см. выше, и применяются в настоящей работе.

Синтез Фрагментов NCOJf-Bal.

На рйюунке 2 показаны в деталях принципы, лежащие в основе концепции 35 - мерных, 30 - мерных, 18 - мерных и 43 - мерных олигонуклеотидов, используемых в синтезе фрагмента Ы С01-ВАМ нэ 65/61 основных пар (рВ). Эти синтезированные 30 -- мерные и 18 - мерные фрагменты фосфори- лируются у них 5 концов посредством пол- инуклеотидокиназы Т4 (Р - L Biochemicals). 1 мкг каждого олигонуклеотида, включая не- фосфорилированные 35 - мер и 43 - мер. гибридизируются в течение трех минут при 95°С в 300 мМол ацетата натрия (рН 7,0), затем медленно охлаждаются при 4°С. Смесь гибридизации используется как таковая в операции клонирования для построения плазмид выражения.

Определение последовательное™ а ми- ЦО-КИ-ОЛЙтных остатков.JUН К..

Анализ последовательности ДНК осуществляется согласно способу, описанно.му A.M. Maxim и W. Gilbert (Proc Matt. Acad Sci США, 74, 1977 г., стр. 560-564 и F. Sanger и др. (Proc. Natl. Acad. Sci, США, 74. 1977 г., стр. 5463-5467).

AjH ayMj3 6..

Скопление клеток, имеющих оптическую плотность в пределах от 1 до 630 нм (IOD630) получали в различных этапах в процессе брожения штаммов, несущих плазми- ды выражения человеческого проапо A--J, pul В9291, pul B9292, pul B9296 и pul B9299 {трансформированы соответственно в штаммах AR58 и IM101 Е.,и в штамме 10544с дрожжей). Каждый образец переводился в суспензию в 50 мМол Трис-HCI буфера, рН 6,8. содержащем 2% додецилсульфата натрия (DSS), 6 Мол. моче- вины, 10% глицерина и 5% 2-меркзптоэта- нола, и этот буферный раствор нагревался при кипении в течении трех минут. Образцы подвергались электрофорезу на полиакриламидных гелях (U.K. Lacmmli. Nature 227. 1970 г, 680-685). Общие белки обнаруживались путем окрашивания синим Комассье, и синтезированный человеческий проапо A-I идентифицировался путем иммунологического распознавания после электрофоре- стического переноса (смотри A. Bolleri и др., см. выше).

Построение рекомбинзнтных векторов для экспрессии человеческого проэпо A-i в бактериях, в дрожжах и в клетках насекомых, зараженных бакуловирусом

1, Клон ДНКс для человеческого препро- апо А-): р иГ вТбОЭ (фиг. 1).

Было отобрано несколько сотен трансформант, получаемых при клонировании ДНКс do. соответствующей поли А+ РНК человеческой печени, в точку PStl плазмиды pBR322. с помощью синтезированного пробника 22 - мерного апо А-1, описанного выше. Один из клонов дает интенсивный сигнал гибридизации в ходе выделен, и данная вставка ДНК, присутствующая в реком- бинантнойплазмиде,была

охарактеризована путем анализа последовательности данной ДНК. Ее длина соответствует 878 парам оснований (Ьр); она кодирует полный полипептид препроапо А- I. Как показано на рисунке 1, данный клонированный фрагмент ДНКс несет некодирующие зоны в 5 и 3 положениях (19 вр и 55 вр, соответственно), последовательность на 54 вр,. кодирующую пептидный предшественник (от аа-24 до аз-7), последовательность на 18 бр, кодирующую про- пептид (от аа-6 до аа-1) и последовательность на 732 Ьр. кодирующую зрелый апо А-l (от аа+1 до аа+2-43), и включает кодон завершения трансляции. Данная последовательность белка, взятая из последовательности ДНК, абсолютно точно соответствует обнаруженным аминокислотам для препроапо А-l из данного белка и из клонов ДНКс, выделенных изолированно друг от друга (W.C. Na-ker и др.. Согг.р. Biochem. Physiol 57В/1977 г., стр. 309-315; Патентная заявка Японии № 96998/86; Р . Cheung и L. Chan, см. выше, и J.J. Seilhsmer и др., см. выше).

2. Построение бактериального вектора экспрессии, включающего последо&ате.ль- ность ДНКс человеческого проапо A--I: рЫ В9291 (Фиг. 2 и 3),

Была построена pul B9291, плазмида, продуцирующая человеческий проапо А-1 путем расположения сегмента, происходящего от клона pUL B1609, за регуляторным промотором лямбда PL (рис. 3). Построение этой плазмиды экспрессии требует синтеза

фрагментов ДНК, включающих ограничительную точку NCOIATG кодон инициирования трансляции и последовательность нуклеотидов, кодирующую аминокислоты от аминированного конца гена со структурой человеческого проапо А-1, до первой уникальной ограничительной точки, Ball (ф«г.

2).

Такой адаптер синтезируется химическими методами (N.D. Slnha и др., см. выше). Получено четыре синтезированных олиго- нуклеотида: после гибридизации они кодируют метионин, соответствующий АТС кодону инициирования трансляции, для шести аминокислот, соответствующих пропеп- тиду, и для 14 первых аминокислот зрелого .человеческого апо А-1 (рисунок 2). Этот синтезированный адаптер служит для снижения до минимума образования вторичных структур у конца 5 гена. Для этого кодоны, отобранные для кодирования аминокислотных групп-6, -1, 1 , 3. 4, 5. 6. 7, 10, 11 и 14, не соответствуют естественным кодонам, имеющимся в ДНКс клона pul В1609.

Описанный выше синтезированный адаптер используется для присоединения фрагмента ДНК на 744 pb, происходящего от pul В1609. к промотору лямбда PL в плаз- миде экспрессии pul В1221.

Построение вектора экспрессии pul В1221 описано в европейской патентной заявке № 186.643. Оно включает три основных этапа, начиная от плазмиды pCQV 2,. Плазмида pCQV2 описана Queen С. в J. Mol. Аррг. Genet. 2,1983 н., стр. 1-10. и легко доступна. Выбор данного типа вектора необязателен: может быть использован любой другой вектор, имеющий промотор, и расположенную ниже от него подходящую точку NCOI. Примерно 0,1 мкг синтезированных фрагментов, таких как описаны выше, сшиваются посредством ДНК лигазы Т4, примерно с 1 мкг фрагмента ВаИ - 744 pb, происходящего от pul В1609 и примерно с 1 мкг плазмидного вектора pUL В1221. отсеченного Bajl/До осуществления операции сшивки фрагмент ВаИ - PStl на 744 pb основных пары обрабатывается ДНК пол- имеразой Т4 таким образом, чтобы происходило преобразование вытянутых концов в положении 3 в свободные концы. Данная процедура хорошо известна для специалистов в данной области и подробно описана Т. Maniatis и др., см. выше.

После амплификации в компетентных клетках штамма AR58 Е. colt перестроенные плазмиды характеризуются путем анализа ограничительных точек и анализа последовательности ДНК синтезированных фрагментов и точек соединения. Рекомбинант- ная плазмида pUL B9291 отвечает всем критериям, поскольку она имеет фрагменты в правильной ориентации и в правильном по- рядке. Она используется для изучения выражения.

3.Построение бактериального вектора экспрессии, содержащего слитые последовательности, соответствующие бета-галактозидазе и человеческому проапо А-1: pul В9296 (фиг. 4).

В данном построении последовательность ДНК, кодирующая человеческий проапо А-1, сливается в фазе правильного

считывания ниже последовательности ДНК бета-галактоэидазы. Ген бетагалактозидэзы присутствует в плазмиде экспрессии Е.соН pUR288, являющейся легко доступной (U. Ruther и MuHer-Hlll, EMBO J, 2, 1983 г.,

1971-1794), которая несет эффективно индуктируемый промотор jac. с соответствующие ограничительные точки в последовательности бета-галактозидазы. Была построена соответствующая рекомбинантная плазмида. как показано на рисунке 4. Прежде всего ДНК плазмиды puR228 отсекается BjAMHj, затем обрабатывается ДНК полимеразой Т4 и снова отсекается .SAIL Затем фрагмент ДНК на 805 pb отделяетея от pUL B9291 путем последовательных операций выравнивания с Kpnl, обработки ДНК полимеразой Т4 и конечного выравнивания с Sail. Эти два фрагмента сшиваются друг с другом в молярных пропорциях посредством ДНК лигазы Т4, и полученная плазмида используется для трансформации компетентных клеток штамма JM101 Е. coll. который является широко распространенным и легко доступным штаммом (АТСС №

33876). Трансформанты характеризуются путем ограничительного анализа на правильную ориентацию последовательности человеческого препро A-I по отношению к гену бета-галактозидазы и на присутствие

воспроизводимой точки В am HI на стыке двух последовательностей. Это показывает, что последовательность человеческого проапо A-I хорошо слита ниже последовательности ДНК бета-галактозидазы и в фазе

правильного считывания. Одна из трансформант, содержащая плазмиду pulB9296, отвечает всем критериям и используется в экспериментах на определение выражения.

4.Построение алазмиды экспрессии дрожжевого носителя последовательности

ДНКс человеческого пррапо A-I: pul §9299

(фигГ5)Г

В данном построении последовательность ДНКс, кодирующая человеческий проапо А-l. клонируется между сигналами промотора и терминатора, которые несет плаз- мида выражения дрожжей. Для настоящего эксперимента выбран данный вектор выражения дрожжей pRIT 10774. Такое построение алазмиды выражения pRIT 10774 описано в европейской патентной заявке 151.102. Она построена, с одной стороны, из плззмиды pRTI 10749. депонированной в АТСС под номером 39133, в соответствии с положениями Будапештского соглашения, и, с другой стороны, из челночного вектора YEp13 для Е. соН - S cereyl|sj.aJL описанного J.R. Breach и др., a Gem 8, 1979 г., стр. 121-133, и который хранится в АТСС под номером 37115 и легко доступен. Вектор pRIT 10774 может реплицироваться одновременно в Е. coll и в дрожжах и несет промотор и терминатор транскрипции ор- нитинкарбамоилтрансферазы (ARG3), разделенных уникальной ограничительной точкой Barn HI, приемлемой для вставки инородной ДНК, имеющей свой собственной АТС кодон инициирования трансляции. Кроме того, данный вектор несет последовательности 2 дрожжей, метаболические маркеры для отбора в дрожжах и марке отбора AmrjA для челночного вектора в Е.соН. Это не единственный вектор, который может быть использован для выражения человеческого проапо А-l в дрожжах: может быть использован любой другой вектор для дрожжевого носителя регуляторного сигнала, и это приводит к качественно одинаковым результатам. Построение, иллюстрированное на фиг. 5. осуществляется следующим образом. ДНК плазмиды pRIT 10774 линейно выравнивается посредством фермента BamHl и обрабатывается ДНК полимеразой Т4.

С другой стороны, фрагмент ДНК на 810 pb отделяется от pul B9291 путем вываривания с ферментами Asjj718 и Sail, с последующей обработкой ДНК полимеразой Т4. Этот фрагмент кодирует человеческий про- зпо А-l и включает ATG кодон инициирова- ния трансляции. Эти два фрагмента, полученные как описано выше, сшиваются друг с другом в равномолярных пропорциях посредством ДНК лигазы Т4, и данная смесь используется для трансформации компетентных клеток Е. coll MM294. Контроль за данными трансформантами осуществляется путем ограничительного анализа, позволяющего проверить правильную ориентацию последовательности ДНК человеческого проапо А-l по отношению к последовательности промотора ARG3. Одна из трансформант содержит рекомбинантную

плазмиду pul B9299, которая пригодна для данного условия. Плазмида pul B9299 амп- лифицируется в Е. coli и- используется для трансформации сфероплэстов дрожжей

5 Saccharomyces cerev s|ae штамма 10 S44c (рер4 - 3- Ieu2 - 3.Teu2 112) (Т. Calezon и др., см. выше). .

Использование штамма 1с 1697d (АТСС № 20631) приводит к качественно зналогич0 ным результатам. Затем трансформанты дрожжей подвергаются испытанию на выражение человеческого проапо A-t.

5. Построение бактериального вектора

се к р е ц и и, в к л а ю ще го.. по ел е д о в ат. едь- 5 ность ДНКс челр веческо.го..про.апо

рЫ1У1612 (,).

В данном построении последовательность ДНК, кодирующая человеческий проапо A-t, сливается в фазе правильного

0 считывания ниже последовательности ДНК сигнального пептида белка ОтрА Е.соИ. Для данного эксперимента выбран вектор секреции pIN - III - ompA - 2 (J. Ghrayeb и др.,ЕМВСи,3, 1984 г., стр. 2437-2442). Этот

5 вектор его хозяин Е. со11 ТА221 доступны и могут быть получены из Отдела Биохимии Государственного Университета Нью-Йорка, Стоуни Брук.

Этот вектор секреции несет сильный

0 промотор Ipp (липопроте н), фрагмент промотора-оператора , последовательность lacj penpeccopajac H соответствующие ограничительные точки, расположенные непосредственно после последовательности,

5 кодирующей сигнальный пептид гена оггщА., Подходящая рекомбинантная плазмида построена как показано на рисунках ба, вис. В первую очередь, вектор секреции pIMI - III

-ompA - 2 линейно выравнивается с EcoRI 0 и обрабатывается ДНК полимеразой Т4, Затем фрагмент ДНК на 805 pb извлекается из pul В 9291 путем выравнивания в последовательном порядке с ограничительными ферментами Kpnl и SAH, и последующей об5 работки ДНК полимера -и Т4. Этот фрагмент кодирует человеческий проапо А-l и содержит ATG кодон инициирования трансляции. Оба фрагмента, полученные как описано выше, сшиваются друг с другом в

0 равномолярных пропорциях посредством ДНК лигазы Т4, и эта сшитая смесь используется для трансформации компетентных клеток штамма JA221 , культивированных в среде М9 (J.H. Muller Эксперименты

5 а молекулярной генетике, Cold Spring Harbor Laboratory Cold Spring Harbor Нью- Йорк, 1972 г.. с, 431), содержащей 20 мг/л триптофана, 20 мг/л лейцина, 2 г/л лактозы и 50 мг/л ампициллина. Эти трансформанты

отобраны на их стойкость к ампициллину и подвергаются отборочному просеву с 18 - мерным синтезированным олигонуклеоти- дом (тот же, что использован в синтезе адаптера, как показано на фиг. 2).

Отобранные трансформанты подвергаются контролю путем ограничительного анализа для проверки правильной ориентации последовательности ДНК проапо А-1 относительно последовательности сигнального пептида, носителем которого является вектор секреции (воспроизводимая точка Eco RI на стыке двух последовательностей). Одна из трансформант несет рекомбинант- ную плазмиду, которая отвечает данному условию. Излишняя последовательность, происходящая от построения с адаптером, подчеркнутая в приведенной ниже нуктео- тиднрй последовательности:

S GTA 6CG GAG GCC GCT GAA TTC ATG AGA CAT TTC TGG 3

Vat Ala CIN Ala A1A Phe Met Arg His Phe Trp

устраняется посредством направленного ак-6 мутагенеза. С этой целью осуществля- ется синтез нижеследующего 24 - мерного олигонуклеотида:

сигнальный пептид- -праапо А-1 5 GTA GCG GAG GCC AGA CAT TTC TGG

Val Ala Gin Ala ARg His Phe Trp лишенного 12 излишних оснований, и он используется для удаления излишней последовательности из 12 оснований, происходящей от адаптера.

Для осуществления мутагенеза используется система Амершам. Эта система основана на способе F. Eckstein и др. (Nucleic Acids Res, 13, 1985 г., 8765-8785). Данный способ обеспечивает высокий выход про- дукта и наиболее высокую эффективность из числа cyinecf вующих способов: вплоть до 95%.

В первую очередь, область ДНК, которая предварительно мутагенизирована, клонируется в вектор М13. С этой целью фрагмент ДНК XfeaJ Ball рекомбинантной плазмиды pIN - III - ouipA - 2, несущий ген прозпо А-i, вставляется в вектор MI3mpl9, отсеченный Xbal H.jnpMJ. Этот вектор MI3mpf9 промышленно доступен; он может быть получен согласно Амершам (Buckinghamshire Великобритания). Затем мутагенный 24 - мерный олигонуклеотид гибридизируется с моноцепочечным мат- риксом и вытягивается фрагментом Кленова ДНКполимеразы в присутствии ДНК лигазы Т4 для получения мутантного гетеродуплек- са.

Избирательное удаление немутэнтной нити возможно за счет ввода тионуклеотида в мутантную нить в ходе синтеза в условиях ин витро и за счет расщепления нить NOI, не подвергнутой фасфоротианатированию. Такие расщепления дают точки для экзонук- леазы ill, которая вываривает нить, не являющуюся мутантом. В таком случае нить, являющаяся мутантом, используется как матрикс для перестройки круговой молекулы с двойной нитью, приводящий к образованию монодуплексной мутантной молекулы. Такой мутагенез подтверждается последовательностью соединения между сигнальными пептидом и началом гена проапо А-1. Данная рекомбинантная плазмида pNIY1612 перестраивается путем сшивки фрагмента Xbal - Hind III в вектора pIN - III - ompA-2 с фрагментом Xbal - ВаЦ, который лишен 12 излишних оснований, и с фрагментом Bal I - Hind UI гена проапо А-1,

Эти три фрагмента линейно выравниваются посредством ДНК лигазы Т4, и данная смесь используется для трансформации компетентных клеток Е, сой TF221, как описано выше. Эти трансформанты отбираются по их стойкости к ампициллину и просеиваются с 18 - мерным олигонуклеотидом, описанным выше. Одна из трансформент несет рекомбинантную плазмиду pN Y1612. В данном крнечном построении последовательность, кодирующая сигнальный пептид отрА предшествует полной последовательности проапо А-1 без кодона ATG (фиг. 6а, б,

с).

Трансформанты Е, col) затем подвергаются испытанию на выражение человеческого проапо А-1.

6. Построение вектора переноса для ввода последовательности ДНКс человеческого проапо A-t в бакуловирус: pNIY1613 (фиг. 7).

Плазмида pNIY1613. несущая последовательность ДНК человеческого проапо А-}, построена путем расположения сегмента, происходящего от клона pul B9291, ниже промотора гена полигедрина бакуловируса (фиг. 7). В данном эксперименте используется вектор переноса рАсРРб бакуловируса(J. Matsnura и др.. J. Gen. Virol 67. 1986 г., с. 1515-1529); он может быть получен из Отделения микробиологии и иммунологии От- тавского университета. Данная плазмида несет промотор сена полигедрина вплоть до нуклеотида - 7 в ведущей последовательности в положении 5 ; в ней отсутствует ATG кодон полигедрина и 170 первых нуклеоти- дов последовательности, кодирующей пол- игедрин. , Желаемая точка Barn HI

расположена ниже нуклеотида -- 7, Построение, иллюстрированное на фиг. 7. осущест- вляется следующим образом. ДНК плазмиды pAcRPG линейно выравнивается посредством BarnHI. Кроме того, фрагмент ДНК на 810 pb извлекается из pul B9291 путем выравнивания с ограничительными ферментами ASp 718 и SAil. Данный фрагмент кодирует человеческий проапо А-l и содержит кодом ATG инициирования трансляции. Эти два фрагмента в равномолярных пропорциях совместно обрабатываются ДНК полимеразой Т4, сшиваются посредством ДНК лигазы Т4 и используются для трансформации компетентных клеток штамма AR58 Е. cpjj. Данные трэнсформанты отбираются на их стойкость к ампициллину, просеиваются посредг-вом 35 - мерного синтезированного олигонуклеотида. меченого 32р (смотри рис. 2), соответствующего части ДНК последовательности проапо A-I, и осуществляется их контроль путем ограничительногоанализа для проверки правильной ориентации данной последовательности ДНК прозпо А -I относительно промотора гена полигедрина. Одна из трансформант несет рекомбинантную плаз- миду. pNIY1613, которая отвечает данному условию; она используется в анализе данного выражения.

7. Продуцирование человеческого про- эпо A-I трансформированными микроорганизмами

Культуры, состоящие из 20 мл штамма AR58 или JM101 Е. coll. трансформирован- ные соответственно pul B9291 и pUL B9296, культивируются в обогащенной среде, дополненной 50-ю мкг/мл ампициллина (культурный бульон LB, смотри Т. Maniatls и др., приведено выше, для проведения экспериментов) до тех пор, пока не достигается оптическая плотность от 0,6 до 630 нм. В случае pul B9291 индукция .промотора лямбда PL осуществляется с созданием исходных условий роста культуры от 30°С до42°С, таким образом, что происходит инактивация подавителя промотора лямбда PL (М. Rorenberg и др., Methods Enzymol 101, 1983 г.. стр. 123-138. Индукция .происходит в течение 20 минут.

В случае pul B9296 индукция промотора осуществляется с вводом в культуру, инкубированную при 37°С, химического индуктора IPTG (изспропил-бета-О-тиогалак- тозид) до тех пор, пока не достигается конечная концентрация 1 мМол (R. Lorenzetti и др., приведено выше). Индукция происходит в течение 60 минут.

С другой стороны, культуры, состоящие из 20 мл дрожжевых клеток 10S44c. трансформированных put B9299, культивируются при 30°С в среде азотированного основания для дрожжей(Difco), дополненных глюкозой (1%), до тех пор, пока не достигается оптическая плотность 0,3-630 нм. Нет необходимости ни в одном индукторе, поскольку в данном конкретном случае данное вырэжение является основным.

Отбираются образцы из 1 мл указанных выше культур и центрифугируются при 15.000 g в течение 5 мин. Полученные осадки лизируются в кипящем додецилсульфате

натрия (DSS). Эти скопления переводятся в суспензию в 50 мкл буфера, содержащего DSS.(50 мМол Трис-HCI, рН 6.8, 2% DSS. 6 Мол. мочевины, 5% 2-меркаптоэтанола и 10% глицерина) и данная суспензия нагревается при кипении в течение 3 мин при 100°С. Затем экстракты центрифугируются при 15.000 g в течение 10 мин. Эти образцы готовы, таким образом, для анализа путем электрофореза на полиакриламидных гелях

концентрацией 15% или7,5% в присутствии DSS, в денатурированных условиях U.K. Laemmli, указано выше).

После электрофореза полиэкриламид- ные гели быстро промываются 40 миллилитрами дистилляционной воды и 40

миллилитрами буферного раствора фосфата

натрия (50 мМол) с величиной рН 7,5. Затем

эти белки электрически переносятся с гелей

на нитроцеллюлозный лист в течение двух

часов при 60 Вольтах и 1,5 Амперах в том же буферном растворе фосфата (Т, Cabeezon и др., см. выше). Нитроцеллюлозные листы насыщаются альбумином (1%) в 50 мМол буферного раствора фосфата натрия с величиной рН 7,5. затем они инкубируются при комнатной температуре в течение ночи и в присутствии сыворотки кроличьего античеловеческого ano A-I при разбавлении 1/500 (и в случае pul B9296 в присутствии моноклональных антител анти-бета-галактозидазы мыши) в том же буферном растворе, лишенном альбумина.

Данные листы пятикратно промываются 40 миллилитрами того же фосфатного буферного раствора и затем инкубируются в 40 мл фосфатного буферного раствора, содержащего 10 мкг/мл сыворотки козьего ан- ти-антитела кролика (или анти-антитела мыши) и подвергаются мечению в перрксидазе. После четырех часов инкубирования при комнатной температуре данные листы снова пятикратно промываются в 40 мл фосфатного буферного раствора и окончательно проявляются путем ввода 50 мл раствора

хромогеиного субстрата (10 мг диэминобен- зидина. 100 мкл перекиси мочевины концентрацией 10% и 100 мМол Трис-HCI с величиной рН 7,6). В случае pul B9291 и pul 89299 обнаруживается уникальный про- 5 дукт, реагирующий с антителами анти-челс- веческого апо АН. Этот продукт имеет молекулярный вес, соответствующий молекулярному весу эталонного естественного апо АН. В случае pul В9296 обнаруживается 10 слитый полипептид размером, предусмотренным для суммы бета-галактозидазы пол- ипептидов и проапо АН (144 кДэ), реагирующий с сывороткой человеческого энти- апо АН и с сывороткой анти-бета-га- 15 лактозидазы. Эти размеры определены предварительно с помощью калибровочной кривой, основанной на миграции эталонов молекулярного веса, находящихся на тех же гелях, что и клеточные экстракты,20

В другом эксперименте культуры 20 мл слоя JA221 Е. coll трансформированные PNIY1612, культивируются в обогащенной среде, дополненной 50 мкг/мл ампициллина (питательный бульон LB, смотри Т, 25 Manlatis и др., указано выше) до тех пор, пока не достигается оптическая плотность, равная от 0,6 до 630 им. Индукция промотора lac осуществляется путем ввода в культуру, инкубированную при 37°С, химического 30 индуктора fPTG (изопропил-бета-О-тиога- лактозид) до тех пор, пока конечная концентрация не будет равна 2 мМЬл. Индукция осуществляется в течение 60 минут. Отбираются образцы этих культур в количестве мя 35 и осуществляется центрифугирование при 15000 g в течение 5 мин. Полученные осадки собираются посредством небольшого осмотического воздействия с целью освобождения периплазмовой фракции (D. Koshland и 40 О. Botstei, Cell, 20. 1980 г, 749-760). Освобожденная фракция переходит в суспензию в буферном растворе образца, содержащем DSS, упомянутый выше, но не содержащем мочевины, суспензия доводится до кипения, 45 центрифугируется и подвергается электрофорезу на полиакриламидном геле концентрацией 12,5% в присутствии DSS с последующим иммунодетектированием после эяектрофоретического переноса. Фрак- 50 ция синтезированного проапо АН обнаруживается в данной клетке, но не в периплазме. Это обусловлено либо тем фактом, что проапо АН не секретируется, либо тем фактом, что эффективность осмотиче- 55 ского воздействий не является оптимальной. Основная фракция проапо АН обнаруживается в свободном состоянии в данной среде после осмотического воздействия, указывая таким образом на то, что белок хорошо секретирован клетками.

8.Продуцирование человеческого проапо АН клетками насекомых, зараженных бакуловирусом

Рекомбинантная плазмида pNIY1613 используется совместно с диким штаммом бакуловируса для совместного заражения клеток Spodoptora frugiperda в культуре. Выборка рекомбинантных вирусов, лишен- нных полигедрина, дала в результате реко- бинэнтные колонии. Рекомбинантный вирус, очищенный от колонии, используется для заражения клеток насекомых. Эта процедура хорошо известна для специалистов в данной области и подробно описана M.D. Summer и G.E. Snlth Справочное руководство по методам для бакуловирусных векторов и операциям для клеточных культур насекомых. Техасский Университет. Колледж Стэйшн, 1987 г.

Этотрекомбинантный вирус испытан на продуцирование проапо А-l иммунологическим способом после электрофоретического переноса и способом электрофореза на полиакриламидном геле концентрацией 12,5% в присутствии DSS, после лизирова- ния клеток посредством буферного раствора RIPA (0,05 Мол буферный раствор Трис-HCI, рН 7,2, содержащий 0,15 Мол NaCI, 1% Тритон Х100, 0,1% OSS, 0,1% де- зоксихолятз натрия и 1 мМол фтористого фенилметилсульфонила, FPMS), и обработки кипящим DSS. Был обнаружен один единственный продукт, реагирующий с антителами анти-челоееческого апо АН. Он имеет молекулярный вес. соответствующий молекулярному весу этанола естественного апо АН, и этот выраженный белок является основным составляющим компонентом общих белков. Концентрация проапо А-l на 1 л культуры, измеренная путем простой радиальной иммунодиффузии (G. Manslnl и др., Immunochem, 2,1965 г., 235-254) составляет примерно 100 мг.

9.Цитоплазматическое продуцирование человеческого проэпо А-l в Е. coif

Использование определенной минимальной среды

Для цитоплазматического продуцирования человеческого проапо А-l посредством Е. соИ в минимальной среде использовалась плазмида pul B9292. Плэз- мида put B9292 была построена путем обмена фрагмента EcoRI - Ncol плазмиды pul В9291, кодирующей промотор лямбда PL, с чем же фрагментом EcoRI - Ncol плазмиды pOTS(M. Resenberg и др., Methods-Enzymol 101. 1983 г., стр. 123-138). Этот фрагмент

EcoRj - Nlcgj вектора pOTS (G. Sevare и др., Се1ТГзбГТ984 г, с. 43-49) содержит также эффективный и регулируемый промотор PL, фага лямбда. Он выращивается в определенной минимальной среде культур 20 мл штамма AR58 Е. coll, трансформированного плазмидой pul B9292. Состав минимальной среды (на литр) следующий: 3 г Na2HPCM 2Н20, 3 г КН2РСМ, 0,5 г NaCK 1 г МНдС, 1.37 мМол MgSO 7H20, 29,5 мкМол, FeCIa 6H2O, 236 мкМол MnSO4 H20, 10 г глюкозы, 1 мг витамина 81, 50 мг ампициллина, питательный бульон культуры LB 1/20 (об/об). Клетки культивируются в данной минимальной среде до тех пор, пока опти- ческая плотность не достигает значения от 0,5 до 630 нм. Индукция промотора лямбда PL осуществляется путем поддержания начальных условий роста культуры от 30 до 42°С так, чтобы инактивировать подавитель промотора лямбда PL (М. Rosenberg и др., указано выше). Индукция осуществляется в течение 60 минут. Отбираются образцы культуры в количестве 1 мл и их пропускают в пресс Френча или центрифугируют при 15 000 g в течение 5 мин. Полученный общий клеточный экстракт или осадок подвергаются обработке DSS при кипении, как описано в разделе 7. После электрофореза и элект- рофоретического переноса обнаруживается один единственный продукт, который реагирует с антителами - анти-человеческой Ало A-I. Молекулярный вес этого продукта соответствует молекулярному весу эталонного естественного апо А-l. Концентрация выраженного проалолипомротеина А-l в определенной минимальной среде составляет 13,5% общих белков, либо установленная концентрация проапо А-l составляет примерно 270 мг на литр культуры.

10. Извлечение, очистка и характери- зация человеческого . проду- транс ф о OJHHJDC ванными микроорганизмами

10.1. Извлечение и очистка.

Осуществляют центрифугирование сырых экстрактов рекомбинэнтного проапо А- I при 4.000 g в течение 15 мин, и осадок извлекают. Поверхностный слой центрифугируют при 100 000 g в течение двух часов. Полученный осадок переводят в суспензию в минимальном объеме буферного раствора (TEN1QO), содержащего 20 мМол. Трис-HCI, рН 7,5: 1 мМол этилендиаминтетрауксус- ной кислоты (ЕДТА), 100 мМол Nad: 1.75 мкг/мл FPMS и 100 мкг/мл мертиолатя натрия (натриевая соль этилртуть-тиосалиции- ловой кислоты), и указанные объемы суспензии и всплаашего слоя отдельно друг

от друга доводятся до начального объема экстракта посредством того же буферного раствора. Затем белок осаждается из обеих суспензий при увеличивающихся концентрациях изопропилового спирта. Методом радиальной иммунодиффузии (G, Manelnl и др., указано выше), используя промышленный эталон апо А-l, определяют фракцию осажденного белка каждой суспензии, которая составляет основную часть иммунореак- тивности, соответствующую человеческому апо АН. Полученная таким образом каждая фракция далее очищается методом хроматографии в колонке с Sephacryl S200, с использованием того же буферного раствора в качестве элюента. Собирают фракции объемом 0.9 мл, и методом радиальной иммунодиффузии в каждой фракции определяют количество общего белка, имеющего имму- нореактивность, соответствующую иммуно- реактивности апо АН. Молекулярный вес белка, элюированного в данных фракциях, определяется путем калибровки колонки с помощью эталонов с известным молекулярным весом, таких как альдолаза, альбумин бычьей сыворотки, яичный альбумин, химот- рипсиноген и цитохром С, в идентичных условиях. Чистота проэпо АН на мг общего белка в основных фракциях, содержащих рекомбинантный проапо АН, выраженная в мг белка, имеющего ту же иммунореактив- ность, что и промышленный эталон апо АН, составляет 95%.

1.0.2. Характеристика.

Ш.2.1. Физические свойства, рекомбиг HjiHTHojQjiftaaTiaAdПри центрифугировании при 100 000 g рекомбинантного проапо АН, очищенного и изолированного от поверхностного слоя и осадка, о изоэлектримеской фокализацией согласно способу М. Catslmpoolas (Anal. Biochem, 26, 1969 г., стр. 54-62) и с применением аутогенерированного градиента с величиной рН от 4 до 6, получается одна единственная полоса с изоэлектрической точкой 4,95. Плазматический апо АН является немного более кислотным и имеет изо- электрическую точку 4,75. Это различие в величине рН равное 0,2 между шоэлектри- ческими точками рекомбинантного апо АН и плазматического апо АН очень близко по значению уже известному различию между изоэлектричеокими точками плазматического апо АН, которое, как уже сообщалось ранее, paBHoO,17(G.L, Mills и др., Lab. Tech. Biochem, Mo. Eiol. 14, 1984 г., стр. 244-245).

Ч го касается молекулярного веса, то ре- комбпнантные проапо АН осадка и поверхностного слоя оба состоят из одной

единственной полипептидной цепи идентичного молекулярного веса равного 29.9± ±1,4 «Да. Человеческий плазматический апо А-1 имеет несколько меньшую длину цепи и его молекулярный вес равен 29,3 ±1,ЗкДа.

10.2.2. Определение OjermiflHpJi 5аРты рекрмбинантного проапр А-1 посредством BTjPS-скатола..

Осуществляется химическое расщепление посредством 3-бром-3-метил-2-{(2-нит- рофенил)тио}-ЗН-индола (BNPS-скатола) согласно способу A. Fontana (Methods Enzymol 25, 1972 г, с. 419-423). 5-10 мкг очищенных белковых препаратов растворяют в 100 мкл раствора фенола (0,15 об/об %). в водном растворе 50% (об/об) уксусной кислоты. Затем добавляют 50 мкл раствора 4,8 мг BNPS-скатола на мл ледяной уксусной кислоты и инкубируют при 25°С в тече- ние 72 ч. Затем добавляют 50 мкл 2-меркаптоэтанола и инкубируют второй раз в течение пяти часов при 37°С. Образцы выпариваются, снова растворяются в 100 мкл воды и трехкратно экстрагируются 200- ми мкл этилацетата. Органически фазы удаляются и водные фазы лиофилизируются и анализируются путем электрофореза на по- лиакриламидной геле - DSS.

В случае химического расщепления BNPS-скатолом, число и размер фрагментов, полученных от апо A-I, могут быть в той или иной степени предсказанными, если принять во внимание, что в используемых экспериментальных условиях BNPS-скатол избирательно отсекается после триптофа- новой группы. Приняв эффективность в каждой точке расщепления за 100%, наибольший фрагмент, который может быть

получен, это С-терминальный фрагмент молекулярным весом 15,4 кДа. Молекулярные веса остальных фрагментов находится в интервале от 0,5 до 5,3 кДа, и ввиду этого они

слишком малы для их обнаружения,

В случае неполного расщепления фрагмент 15,4 кДа будет вытянутым в направлении N-терминального конца, образующего соответственно фрагменты

молекулярными весами 20,7 кДа, 23,1 кДа, 27,6 кДа. Такие предложения вполне реальны для человеческого плазматического апо А-1, так же как для других очищенных препаратов рекомбинантной проапо А-1.

Формула из обретения

Способ получения последовательности ДНК, содержащей фрагмент, кодирующий человеческий проаполипопротеин А-1, предусматривающий получение клонов ДНК путем клонирования фрагмента ДНК в pBR 322, выбор клона, кодирующего препроапо- липопротеин А-1, выделение последовательности ДНК из выбранного клона, отличающийся тем, что, с целью обеспечения

наилучшей экспрессии человеческого про- аполипопротеина А-1, клонируют фрагмент кДНК, полученный путем лигирования Ball - Pstl фрагмента последовательности ДНК, кодирующей аминокислоты +15 - +243 проаполипопрбтеина A-f, с синтетическим фрагментом со следующей последовательностью ДНК: 5 - ATG AGA CAT TTCTGGCAGGAGGACG ААССТССАСААТСТ CCTTGGGATAGAGTtA AGGACTTG - 3, кодирующей аминокислоты от -6 до +14 полипептида и включающей кодон инициации трансляции, а также модифицированные ко- доны для аминокислот -6, -1, +1, +3, +4. +5, +6,+7, +10, +11 и +14.

10 2D 30 . «0 5060 70

7(ШШ5(даГСШ7ЬҐадШШЗ

И К А А V L 1 L А V L F I Т $ S О Л Л К -20-Ю

Ю 9Q 100 ВО 120 130 WO ISO Ша«ШтТ&№ШШ ГШ

F И CODE Р Р Q S Р Н D R VК D I А 1 V Y V D V L

w20

1

Использование: генетическая инженерия, рекомбинантная технология получения. Сущность изобретения: способ получения последовательности заключается в том, что в вектор р BR322 клонируют фрагмент ДНК. полученный путем сшивки Batl-Pstt фрагмента, кодирующего аминокислоты + 15-+24 с фрагментом ДНК, кодирующим аминокислоты от -6 до +14 полипептида и включающим кодом инициации трансляции, а также модифицированные кодоны для аминокислот: -6, -1, +1, +3, +4,+5,+6,+7.+10,+11 и+1 , получают клоны и отбирают клоны, кодирующие человеческий проаполигтопротеин А-1. 7 ил.

160 170 1Ю

W 200 210 2Ю 230

I i I I I I Т

Spwre

зо«

2Ш 2SO 260 270 280 2ЭО 300 510

«ШОАЮШЖШ

К Н D S У Т S Т F S К I R Е Q I G Р V Т О I F V В II L

SO®70

32D 350 340 390 360 370 380 390 Ш№тШШТ(ШЯШШ

Е К Е Т Е € 1 R О Е П S-K Ъ I Е Е V КА К V О Р Y L 80 90100

адо w т «о ш бо адо адо

ШШ1€С ШСТ(ЮОШШШО U D F ft К К « О ЕЕ И Е I Y R О К V Е Р I R А Е L d

11D аX®

фуг. /

1834904

&) я sio sz) SY cm

f JffWf

5эо 570 sao ею еао в «n

ЧЯтаТУТГ

.иг RlEaJ

6 es ею PD Јso ею тт ™

гттата

H)230

720 т ,.. ЯО 750 7БО 770 7m

21022)230

.790 800 Ш 820 830 840 & - т

ЙОStep

870 878 ТШШК&jslte Ncol 2./T04Ka gofr

у 5-, э,,,

«тсАглоттгствбоесгебпсбплсасслс. mтегсатгошлиGTTAASслстеG

3V 18-ш6ге - 5 . .

Та Ш АТС «X GTC СТС СТО СТТ GGA GGI 6 IT AGA GGfl АСС СТА ТСГ САД ТТС CTG ААС С

Met Arg His Mie Trp Gin Gin

лрр СЬ« Гго Гго Gin Set Pro Trp Лпр Лгд Val Ц-n Ляр lei AU«)

-6 -3-1 ; 14-3 . 1649

+i2+H

МН2-терминаль- пропептид -ный метионин 9a g sa j)

t

site dc cliVao

точкп расщепления л пропоптилаэы A-I wuz.t.

1834904

sio

+i2+H

Зрелый ario A-l (Щ-аа, tin-о

BAL

чрепроапо A-I

I

PST BAL

74 ДНК полшераза

I

STOP

Т13./ от крытый PST( цикл Я

BAL rsrii цикл APO A-I (AAj5 - STOP)

Ncol

AT6

синтезированная ДНК (MET.AA.g AA)

АмрА

АмрА

АмрА

сшивка

проапо A-I

стоп

Фиг.З

АмрА

SAL

ВлнН

ВАмН

Т/ ДНК пол тле раза

SAL

SAL

JAHHI SALI

(открытый

цшеи ATGстоп

805РБ

13

АмрА

АмрА

ALI

п

13 Проапо A-I

сшивка

стоп проапо A-I

ATG ВлмН

Фиг. 4

ВАмН

ТИДНК полимераза;

открытый цикл

FRANCS

ASP 718 о крктый(открытый никл)

ASP 718,SAL

ТлДНК полимераза

ш.

ATG STOP 810РВ

30 проапо A-I

Фиг. 5

АмрА

AwA

а

сигнал %itf

f

EcoRI

роапо A-i

Лроапо A-I

Q СТОП

SAL 805рв

игнал QMpfl

LPPP C .{&ючаоиэ6 еденинЈ)

Проапо A-I

Фиг. 6

1834904

проапо A-I стоп

HlNDlII

I XBAl

I HIND И

АнрА

АмрА

ХВА

мутагенез,регулируемый ATG олигонуклеотидами.

BAL

ХВА

YyATG

А-1 Менее-Моаю- «JBAL бании

4 Фиг.6

LPppLA poV

npoano A-I

Фиг. 6

ASP718 ATG

npoa.no A-I

проапо А-

стоп SAL

810PB

Фиг.7