Способ получения полипептида со свойствами гирудина Советский патент 1992 года по МПК C12N15/15 

Изобретение относится к генетической инженерии и в частности к способу получения полипептида со свойствами гирудина.

Известен способ получения полипептида со свойствами гирудина, предусматривающий конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК, кодирующей HV1 или HV2, трансформацию полученными ДНК штаммов Saccharomyces cerevisiae, культивирование трансформированных дрожжей, выделение и очистку предшественника гирудина с последующей активацией 1.

Недостаток известной конструкции плазмидной ДНК состоит в том, что гирудин экспрессируется в форме предшественника, который имеет два сайта расщепления. Когда расщепление происходит по первому сайту, получают более длинную форму, чем активный гирудин, который отличается от

гирудина активного удлиненным остатком аминокислоты с МНа-концом.

Предшественник загрязняет зрелый гирудин на различных стадиях его очистки и это усложняет способ очистки и приводит к снижению выхода чистого препарата гирудина.

Предложенные плазмиды имеют только один сайт расщепления, расположенный перед N-терминальным концом гирудина. Расщепление в этом месте и позволяет получить сразу зрелый гирудин и избежать в дальнейшем энзиматического расщепления, или этапов обработки бромидом циано- гена и ренатурации протеина.

Целью изобретения является упрощение способа. Способ предусматривает конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК pTG61828 или pTG1891. или pTG1833,

X VI О ГО XJ О

кодирующей HV1 или HV2, трансформацию полученными ДНК штаммов Saccharomyces cerevlslae, культивирование трансформированных дрожжей, выделение и очистку целевого продукта. Причем эти плазмиды имеют следующую последовательность:

Str-Lex-Scl-ген Н

где Н - ген, кодирующий гирудин HV1 или HV2;

Str - представляет собой промотор гена PG К дрожжей;

Lex - последовательность, обеспечивающая секрецию полового феромона дрожжей;

Scl - последовательность, кодирующая участок расщепления протеина; т.е. один кодом АТС или два кодона, кодирующих Lys-Arg или пять кодонов, колирующих Ser-Leu-Asp-Lys-Arg Lex последовательность представляет собой пре-про последовательность, которая выделяет половой альфа феромон дрожжей.

Хотя в данной конструкции последовательность L происходит от гена полового альфа феромона дрожжей, в принципе могут быть использованы другие системы (например, система белка Киллера).

Последовательность Str означает промотор гена PGK дрожжей, который отличается от промотора гена М Ральфа 1. В предложенном способе используют промотор гена PGK, что позволяет добиться экспрессии гирудина независимо от полового сигнала штамма-хозяина.

Плазмидные ДНК могут содержать, кроме того, начало репликации в дрожжах, например, начало репликации плазмиды 2 .

Данные плазмиды обеспечивают репликацию в E.coli, например, начало репликации, такой как репликации pBR322, и маркер селекции, например, apMR. Эти плазмиды будут также нести маркер селекции дрожжей, например, ген, кодирующий устойчивость к некоторым токсичным химическим соединениям, или ген, ИНАЗ.

Для управления экспрессией и секрецией гирудина в культуральную среду, соответствующий ген вводят в вектор дрожжей или в плазмиду, содержащую начало репликации в дрожжах. Плазмиды содержат следующие элементы:

-начало репликации плазмиды дрожжей 2 /4,

-ген игаЗ

-начало репликации в E.coli и маркер устойчивости к антибиотику,

-область 5 гена М Ральфа 1. которая содержит промотор транскрипции, лидер- .ную последовательность и последовательность пре-про предшественника фактора альфа, эта последовательность слита с последовательностью, кодирующей гирудин HV1,

5- терминатор транскрипции гена PGK

дрожжей, размещенный ниже гена гирудина. Данные конструкции вводят в дрожжи, в частности в Saccharomyces или в плазмиду для автономной репликации, или в хромосо0 ме дрожжей.

Когда плазмида является автономной, она содержит элементы, обеспечивающие ее репликацию, т.е. начало, репликацию такое как у плазмиды 2/г. Кроме того, плазми5 да может содержать элементы селекции, такие как ген HRA3 или LEH2, которые обеспечивают комплементарность дрожжей Ura3 или Ieu2. Эти плазмиды могут также содержать элементы, обеспечивающие их

0 репликацию в бактериях, например, начало репликации, такое как у pBR322. маркерный ген, такой как Амрг.

Когда промотор является таким, как у гена феромона альфа, дрожжи будут пред5 почтительно полового типа Matalpha. Можно использовать, например, штамм гентипа игаЗ или 1еи2, или другой, комплементарный плазмиде, для обеспечения удержания плазмиды в дрожжах при соответствующем

0 давлении селекции.

Получают гирудин культивированием трансформированных дрожжей в культу- ральной среде и выделяют его из культу- ральной среды в форме созревающего

5 предшественника гирудина In vitro или in vivo.

Созревание может быть проведено в несколько этапов. Сначала расщепляют некоторые элементы, происходящие от

0 трансформации последовательности Lex, это расщепление проводится на уровне последовательности, соответствующей Scl. Зрелому гирудину предшествует селективное отщепление метионина бромидом циа5 ногена. Последовательность, кодирующая гирудин, не содержит метионина.

Предусмотрено отщепление на N конце депиптида Lys-Arg. В некоторых случаях необходимо предусмотреть ферментативное

0 расщепление после секреции при добавлении специфического фермента.

В некоторых случаях после обработки бромидов цианогена необходимо денатурировать белок, воссоздавая дисульфитные

5 мостики. Для этого белок денатурируют, например гуанидинхлоридом, потом денатурируют в присутствии восстановленного и окисленного глютат-иона.

В частности гирудин HV1 используют в фармацевтических композициях, один или в

сочетании с другими активными продуктами, или же в рамках тестов или диагностики In vitro или In vivo.

Пример 1. Плазмида pTG897 несет информацию для предшественника гирудина, который содержит только один сайт рас- щепления для протеиназы yscF. В результате обработки протеинэзой yscF высвобождается молекула гирудина, удлиненная у NH2 на 4 остатка G и Ala Clu и Ala. Делеция фрагмента ДНК, кодирующего эту последовательность Glu и Ala Glu Ala, приводит к получению зрелого гирудина. Эту делецию осуществляют с помощью сайт специфического мутагенеза invltro.

Плазмиду pTG897 гидролизуют Pst1- Вдб рестриктазой. Фрагмент ДНК, содержащий последовательность гирудина, клонируют в репликативной форме однони- точного фага M13TG131, чтобы создать фаг M13TG 897.

Гибридизируют олигонуклеотид последовательности:

5 -TCTTTGGATAAAAGAATTACGTATACAGAC-3

с геномной ДНК этого фага M13TG 897. Этот олигонуклеотид гибридизируется в своем первом фрагменте (15 пар оснований) с последовательностью из 15 пар оснований не- посредственно выше делецируемой последовательности, а вторым своим фрагментом с последовательностью из 15 пар оснований непосредственно ниже. Этот олигонуклеотид служит матрицей для синтеза In vitro комплементарной нити генома фагаМ13ТС897. Последействия Т4 ДНК ли- газы полученными гибридными ДНКтранс- фецируют бактерию- реципиент М103 /А/ /Lac-Pro/SupE Thi EndIA Sbcb15 strA rk- mk+1 F TraD36 ProAB + Lac1° LacZ A M15/ и анализируют фаги, полученные при этой трансфекции путем гибридизации ДНК- ДНК, используя в качестве зонда нуклеотид, описанный ранее и меченый 32р путем kinatlon.

Пример 2. Получают плазмиду pTG876 после удаления Bgtll сайта в плаз- миде pTG883, который находится вблизи терминатора транскрипции гена PGK.

Для этого частично гидролизуют эту плазмиду pTG876 с помощью Bgl1, обрабатывают фрагментом Кленова ДНК полиме- разы 1 E.coli в присутствии 4 нуклеотидов и ковалентно соединяют молекулы ДНК друг с другом при действии ДНК лигазы фага Т4. Плазмида pTG883 имеет только один сайт Bgell, расположенный выше промотора гена феромона.

Плазмиду pTG883 (20 мг) обрабатывают , потом подвергают гидролизу нуклеа- зой Ва131 (1,4 единицы, 10 минут). Обработанную таким образом ДНК очищают 5 последовательными экстракциями фенолом и хлороформом - изсамиловым спиртом, за- тем фракцию (5 мг) подвергают действию полимеразы Кленова, чтобы получить максимальное количество свободных концов.

0 Обработанную таким образом ДНК лигиру- ют с нефосфорилированными линкерами BamH1 /5,CGGATCCCG/ в присутствии лигазы фага Т4. После трансформации E.coli 1106 и селекции на устойчивость к ампицил5 лину выделяют плазмиду pTG892, делециро- ванную в области 5, располагающейся сбоку гена MFalphal, линкер ВатН1 локализован на основании выше АТС. S -CGGGATCCCG A ATG AGA TTT

0 линкер ВатН1Часть, кодирующая

MFalpha 1-2

Новый фрагмент BamH1-Sal1 клонируют между сайтами BamH1 - Sail фага М13Т

5 G120, чтобы получить фаг M13TG889. Из фага M13TG889 изолируют фрагмент ВатН1 - , содержащий фрагмент, кодирующий феромон альфа, чтобы лигировать его с большим фрагментом Bgll плазмиды В

0 pTG892 в содержит фрагмент BamH1-Bglli, соответствующий части, кодирующей феромон, вставленный позади сайта Bgll промотора гена PGK.

ДНК pTG892 содержит один сайт Bglll,

5 один сайт Sail два сайта епс adrent короткой последовательности, содержащей сайт Pstl. При двойном гидролизе Bgll и Sail, элюции, большого фрагмента и лигации с синтетическим полилинкером замещают ко0 роткую последовательность:

5 GATCCAGCTGACATCTGCATGCG GTCGACTGTAGACGTACGCAGCT-5 и обладают липким концом Bglll, липким концом Sail, а также сайтами рестрикции

5 Pst1, Bglll иЗрЫ.

Полученный таким образом новый вектор обозначают pTG1819. ДНК этого вектора гидролизуют Sph1 и Pst1. При двойном гидролизе получают три фрагмента: один

0 Pst1 - Pst1 6,5 кв, один Pst1 - Sph 1,9 KB и другой Sp1 Pst1 0,5 кв.

Два более длинных фрагмента очищают и смешивают с фрагментом Spg1 -Pst1, соответствующим зрелому гирудину и проис5 ходящим из фага M13TG1827, и получают вектор экспрессии: pTG 1828.

Пример 3. Частично обрабатывают ДНК pTG881 с помощью Pst1 и получают фрагмент 6,1 кв. Этот фрагмент изолируют, потом гидролизуют Bglll, высвобождают 2

фрагмента Pst1 - Pst1 и Pst1 - Bglll. Эти два фрагмента лигируют с фрагментом Pst1 - Bglll 0,62 кв, из pTG1828. Таким образом получают новый вектор pTG1833, который отличается от плазмиды pTG897 делецией последовательностей, кодирующей GIu - Ala-Glu-Ala. Эта плазмидарТ01833 имеет начало репликации для E.coll, ген устойчивости к ампициллину, ген Leu2 S.cerevlslae, фрагмент плазмиды 2,м, который обеспечивает репликацию в S.cerevlslae промотор гена MFalpgal, кодирующий пре-про, и ген гирудина.

П р и м е р 4. Трансформируют штамм S.cerevlfslaeTGYI sp4/Matalpha ига 3-251- 373-328 hls-11-15/ плазмидами pTG1818. pTG1828 и pTG1833. Результаты показывают, что pTG1818 и pTG1833 вызывают секрецию гирудиновой активности на одинаковом уровне. Напротив, TGY1 sp4 pTG1828 секретирует в два раза меньшую активность гирудина, чем два других штамма. Также сравнивают синтез гирудина, сек- ретируемого штаммами S.cerevlsiae /Mata/ TGY14-1, трансформированным или PTG1828 или PTG1833 и TGY14-2, трансформированными теми же плазмидами (табл. 1-2). В случае штамма TGY14-2 (половой тип Matalpha) плазмида pTG1833 обеспечивает лучшую секрецию гирудина, чем плазмида pTG1828. Напротив, в случае штамма TGY14-1 (половой тип Mata зЕПШЗ не вызывает секрецию гирудина, как ожидалось, тогда как NG14-2 продуцирует гирудин.

Пример 5. Из штамма TGY1 sp4 pTG833 выделяют спонтанные мутанты, способные образовывать колонии на полной среде (YPG), дополненной 1 мг/мл 5- фторурацила. 6 мутантов культивируют на полной среде и выбирают один, который не обладает ни одной выжившей колонией для плазмиды после более 20 генераций pocia в неселективных условиях.

Мутант, названный TGY1 sp4-3, используют для продуцирования гирудина в полной среде.

Пример 6. Эта последовательность несет элементы слияния последовательности HV1 с частью пре-про и сигналами, обеспечивающими правильное вызревание секретированного гирудина, в частности, область соединения должна содержать дублет Pys-Arg сразу выше первого остатка гЛНа-концеврй GV1,

Синтез осуществляют из двух отдельных блоков, которые затем объединяют, Первый блок содержит 9 олигонуклеотидов, пронумерованных от 1 до 9, а второй блок содержит 10 нуклеотидов, пронумероеан- ныхот 10 до 19.

Пример 7. Олигонуклеотиды 2-8 (фосфорилируют по их 5,-концам, чтобы избежать образование димеров или полимеров: 500 пикомолей каждого олигонуклеотида обрабатывают полинуклео- тидкиназой (2 единицы) в конечном объеме 25 мкл Трис HCI 60 мМ, рН 7,5, MgCIa 10 мМ, дитиотрейтол 8 мМ, содержащем 3,3 пмолей гамма-АТФ 32р (500 кюри

0 (нмоль), после 15 минут инкубации при 37°С прибавляют 5 нмолей немеченой АТФ. После инкубации при 37°С в течение 30 минут комплементарные фрагменты гибридизиру- ютдва на два, за исключением фрагментов

5 1, 2 и 3, эти последние смешивают вместе. Используют 300 пмолей каждого олигонук- леотида в конечном объеме 10 мкл Трис HCI 66 мМ, рН 7,5, MgCIa 6 мМ, NaCI 100 мМ, спермидин 0,5 мМ, ДТТ 8 мМ.

0 Каждую смесь нагревают при 100°С в течение 3 мин, затем охлаждают медленно до 37°С в течение 2 ч. Гибридизированные олигонуклеотиды l-2-З смешивают с олиго- нуклеотидами 4-5 и инкубируют при 37°С в

5 течение 2 ч. Таким же образом проводят гибридизацию пар нуклеотидов 6-7 и 8-9. На последнем этапе объединяют 9 нуклеотидов, предварительно обработанных таким образом, их инкубируют 2 часа при 37°С в

0 коночном объеме 100 мкл.

14 пмолей этих гибридизованных олиго- нуклеотидоо подвергают обработке лигазой Т4 в течение 15 часов при 15°С. Затем к реакционной смеси прибавляют 50 нг боль5 шого фрагмента Hind Ill-Bam H1 M13TG131, предварительно очищенного на геле. Лиги- рованную смесь используют для трансформации клеток E.coll Ml03. Среди 12 клонов полученных таким образом фагов один об0 ладает искомой последовательностью: M13TG1888.

Используют ту же самую стратегию для синтеза второго блока, который клонируют между сайтами BamH l и Sail фага

5 M13TG131. Два клона на 12 гестов имеют вставку, соответствующую искомой последовательное ги. Один из этих клонов назван M13TG1889.

Две дпуниточные ДНК M13TG1888 и

0 M13TG1889 гидролизуют рестригазами Hlndlll и ВатЖ и Sail, смешивают с большим фрагментом Hindlll - Sail, очищенным на геле. Лигированную смесь подвергают трансформации Е.соП 1106. После селекции

5 на устойчивость к ампициллину получают плазмиду pTG1890, которая содержит правильно реконструированную синтетическую последовательность.

Пример 8. Hindlll - Bdlll фрагмент ДНК pTG1890 несет последовательность,

кодирующую HV1 (сайт Bglll расположен сразу выше сайта Sail, который служит при предшествующем клонировании (для вставки между сайтами Hindll и Bglll плазмиды pTG881. В полученной плазмиде pTG1891 ген PV1, последовательно, оказывается вставленным между последовательностями пре-про NFaipha и терминатором транскрипции. Такая конструкция 1 обеспечивает созревание и секрецию гирудина HV1, потому что она является идентичной pTG1818, за исключением последовательностей, кодирующих HV2, которые заменены последовательностями HV1.

П р и м е р 9. Штамм TGY1 sp4 (alpha-1 ura 3-251-373-373-328, HiS 3-11-15) трансформируют плазмидой pTG1891, 2 клона полученных селекцией на ura+, культивируют и определяют л редуцирование гирудина, секретированного в культуральную среду. В качестве контроля определяют в тех же условиях количество гирудина,секретированного NGY1 sp4pTG1818.

Определяют в два раза большую анти- тромбиновую активность при поверхност- ном культивировании штамма TGY1 sp4 pTG18191 (0,9 мг/л поверхностной культуры), чем в культуре штамма TGY1 sp PTG1833.

Депонирование штаммов-представите- лей изобретения.

Следующие штаммы депонируют в Национальной коллекции Культур Микроорганизмов Института Пастера 16 июня 1986 года.

Saccharomyces cerevlsiae TG1Y sp4 pTG1828 под № 1-569

Saccharomyces cerevlsiae TGY1 sp. 3pTG1833 под № 1-570 б ноября 1986 года.

Saccharomyces cerevislae HTGY1 sp4 p TG1891 под№ 1-623.

Формула изобретения

Способ получения полипептида со свойствами гирудина, предусматривающий конструирование рекомбинантной плаз- мидной ДНК, кодирующей HV1 или HV2, трансформацию полученными ДНК штаммов Saccharomyces cerevlsiae, культивирование трансформированных дрожжей, выделение и очистку целевого продукта, о т- личающийся тем, что, с целью упрощения способа, конструируют рекомбинант- ные плазмидные ДНК pTG1828, или PTG1833, или DTG1391, содержащие последовательности

Str- Lex- Sci -ген Н,

где Н - ген, кодирующий гирудин HV1 или HV2;

Str- представляет собой промотор гена PGR-дрожжей;

Lex - последовательность, обеспечивающая секрецию полового феромона дрожжей;

Scl - последовательность, кодирующая участок расщепления протеина, т.е. ATG или два кодона, кодирующих Lys-Arg, или пять кодонов для Scr - Leu - Asp - Lys - Arg.

Приоритет по признакам:

10.07.86 соответствует плазмидам PTG1828 и pTG1833, т.е. гирудину HV2;

01.12.86-плазмиде pTG1891, т.е. HV1.

Использование: генетическая инженерия и получение полипептида со свойствами гирудина. Сущность изобретения: способ предусматривает конструирование реком- бинантной плазмидной ДНК pTG 1828 - или pTG 1891, или pTG 1833, кодирующей HV1 или HV2, трансформацию полученными ДНК штаммов Saccharomuces cerevisiae, культивирование трансформированных дрожжей, выделение и очистку целевого продукта. Причем эти плазмиды имеют следующие последовательности Str-Lex-Scl- ген Н, где Н - ген, кодирующий гирудин HV1 или HV2, Sir- представляет собой промотор PGR-дрожжей; Lex-последовательность, обеспечивающая секрецию полового феромона дрожжей; Scl - последовательность, кодирующая участок расщепления протеина, один кодон ATG или два кодона, кодирующих Ser-Leu-Asp-Lus-Arg; Lex - последовательность представляет собой пре-про последовательность, которая выделяет половой альфа феромон дрожжей. 2 табл. ел С

Таблица 1 Антитромбиновая активность гирудина, секретируемого штаммами дрожжей

Антитромбиновая активность гирудина,-секретируемого штаммами дрожжей

40

Таблица 2