СПОСОБ ВОССТАНОВЛЕНИЯ КОЖНОГО ПОКРОВА У ПАЦИЕНТОВ С ОБШИРНЫМИ РАНАМИ С ДЕФЕКТОМ МЯГКИХ ТКАНЕЙ (ВАРИАНТЫ) Российский патент 2014 года по МПК A61B17/00 A61K35/12 A61K35/36 A61P17/02 

Изобретение относится к медицине и биотехнологии и может быть применено для лечения обширных травматических дефектов в хирургии, травматологии и комбустиологии.

Основным методом лечения обширных травматических дефектов является первичная хирургическая обработка (ПХО) раны с последующей отсроченной кожно-пластической операцией для закрытия дефекта кожи [Алексеев А.А., Светухин A.M., Кузнецов В.А. Современная стратегия и тактика лечения ожогов, ожоговой болезни и обширных гнойных ран. Последипломное образование на современном этапе. - М. - 2000. -с.277-284].

Для закрытия раны применяют аутодермопластику (АДП) расщепленным лоскутом. Однако результаты АДП в гнойной хирургии остаются не удовлетворительные, что связано с неполной регенерацией кожи и формированием рубца [Губин М.А., Эктов В.Н., Лакатош К.О. Ранние реконструктивно-пластические операции в лечении больных, перенесших термическую травму головы и шеи: Человек и его здоровье. - Курск. - 2000.- Вып. 3. - с.83-84]. Подчеркнем, что при АДП требуется получить кожный лоскут с интактной поверхности тела пациента, что создает дополнительные трудности.

Развитие клеточных технологий открывает новые возможности лечения ран с использованием различных клеток, в том числе мезенхимальных мультипотентных стромальных клеток (ММСК). В клинической практике используют аллогенные или аутологичные клетки. Тип используемых клеток определяется предполагаемой тактикой лечения, обусловленной характером патологического процесса. Для стимулирования регенерации за счет резидентных прогенеторных клеток применяют биологически активные факторы, выделяемые из аутологичных или аллогенных клеток при их разрушении in situ или in vitro. В частности, эффективность методики показана в лечении пограничных ожогов, когда сохранен источник регенерации кожи, для стимуляции которого используют аллофибробласты.

При дефиците резидентных прогенеторных клеток выполняют их аутотрансплантацию из интактных областей.

Аллогенные и аутологичные ММСК стимулируют процессы регенерации раны. Существует способ лечения ожоговых ран IIIа степени разработанный в НИИ СП им. Н.В. Склифосовского, заключающийся в наложении на ожоговую рану повязки, содержащей аллофибробласты [Патент №2320349 «Способ лечения ожоговых ран». 27.03.08; №2373944 «Способ лечения ожоговой раны». 27.11.09]. Однако способ эффективен для стимулирования заживления только поверхностного термического дефекта кожи (например, ожог IIIа степени), при котором сохраняются прогениторные клетка в дериватах кожи (волосяные фолликулы). При более глубоких дефектах кожи и, следовательно, отсутствии резидентных прогениторных клеток метод неэффективен. Трансплантация в рану аутологичных ММСК из других источников позволяет стимулировать регенерацию покровных тканей [Клинико-экспериментальное обоснование применения аллогенных фибробластов для лечения ожоговых ран III А степени. / Жиркова Е.Ю. Дисс.канд наук 2011. С.57]

Наиболее близким техническим решением, принятым за прототип, является методика получения и использования дермального матрикса (ДМ), комбинированного с аутологичным лоскутом [WANG Jing,SUN Shu-guang, WANG Liang-xi, WU Jing, MAO Xue-fei «Repair of scar deformities by composite grafting of acellular dermal matrix with razor thin autoskin» Journal of Southeast China National Defence Medical Science 2006-04]. Способ используют для устранения послеожоговой рубцовой деформации. Производят иссечение рубца до подкожно-жировой клетчатки. На донорском участке заготавливают аутологичный расщепленный кожный лоскут соразмерно дефекту. На рану последовательно укладывают ДМ с аутологичным кожным лоскутом пациента. Основным недостатком метода является увеличение раневой поверхности в два раза при заготовке лоскута аутологичной кожи соразмерно иссеченному рубцу. При этом метод применяется только при лечении операционной раны, формируемой при устранении послеожоговой рубцовой деформации. Кроме того, для устранения рубца требуется дополнительная операция с адекватным анестезиологическим пособием.

Таким образом, для лечения пациентов с обширными травматическими дефектами мягких тканей требуется разработка нового способа, применимого при ранах разной этиологии, на разных этапах лечения, позволяющего комбинировать ДМ со стволовыми клетками, в том числе с алло- и ауто-ММСК и резидентными столовыми клетками.

Достигаемым техническим результатом предлагаемого способа является оптимизация заживления раны кожи и мягких тканей за счет стимуляции процессов регенерации стволовыми клетками, в том числе с алло- и ауто-ММСК и резидентными столовыми клетками. Результат достигается за счет использования ДМ как оптимального биосовместимого носителя для клеток и для создания необходимой микросреды в ране, стимулирования процессов регенерации за счет комбинации с гомогенизированной аутологичной кожей или инъекциями аллогенных ММСК в область раны. Предложенный метод можно применять на разных этапах лечения: как во время ПХО раны, так и отсрочено после подготовки дна раны.

Трансплантированные аллогенные клетки в области раны сохраняют свою жизнеспособность в течение 2-3 суток. При их разрушении выделяются биологически активные вещества, способствующие ускорению ангиогенеза и миграции клеток в область поражения, что позволяет сократить фазы раневого процесса и тем самым ускорить процессы регенерации.

Аутологичная измельченная кожа, вносимая в перфорацию дермального матрикса, является источником собственных резидентных столовых клеток. При этом аутологичные фрагменты кожи могут приживаться на дне раны, формируя островки эпителизации и являясь источником факторов роста, что особенно важно при обширных дефектах кожи, когда заживление вторичным натяжением может занимать длительное время.

Экспериментальное обоснование применения утильных тканей в качестве источника аутологичных клеток

С целью оценки возможности использования утильных тканей в качестве источника аутологичных клеток проведено выделение и культивирование клеток из лоскута кожи, удаленного во время первичной хирургической обработки рвано-ушибленной раны плеча. После иссечения поврежденные ткани помещали в среду для культивирования клеток ДМЕМ с добавлением гентамицина (10:1) и сохраняли до трипсинизации 11,5 часов при температуре +4°С.

В стерильном боксе фрагмент лоскута извлекали из транспортной среды, помещали в чашку Петри диаметром 90 мм и фрагментировали ножницами на кусочки 1-3 мм³. Измельченный материал трижды промывали физиологическим раствором, затем сливали промывную жидкость и добавляли 10 мл 0,25% раствора трипсина, подогретого до 37°С. Чашку Петри с кусочками ткани и трипсином помещали в термостат с температурой 37°С на 30 минут.

После инкубации смесь пипетировали для выделения из кусочков ткани отдельных клеток и небольших конгломератов, действие трипсина ингибировали добавлением эмбриональной сыворотки фирмы «Gibco».

Полученную смесь переносили в центрифужные пробирки и центрифугировали 10 минут при скорости 1000 об/мин.

Супернатант удаляли, а осадок ресуспендировали в питательной среде для культур клеток ДМЕМ с глютамином с добавлением 10% эмбриональной сыворотки, гентамицина (40 мкг/мл) и инсулина (5 мкг/мл). В течение 1 минуты дали осесть крупным кусочкам ткани и после этого надосадочную жидкость распределили на 2 чашки Петри диаметром 40 мм, в одной из которых находилась повязка на основе коллагена I типа человека.

При просмотре капли клеточной суспензии, полученной в результате трипсинизации и окрашенной витальным красителем, обнаруживали скопления различных по морфологии живых клеток.

Спустя 8 суток после посадки первичной клеточной взвеси много округлых клеток разного размера прикрепились ко дну чашки Петри, а часть из них - к находящимся во взвеси коллагеновым волокнам. Отмечали клетки, находящиеся в метаболически активном состоянии. Из мелких округлых клеток начали образовываться единичные фибробласты - вытянутые клетки веретеновидной формы. Наблюдали митотически делящиеся клетки. Через 9 суток после посадки первичной клеточной взвеси сформировался неплотный монослой клеток. Фибробласты образовывали «ячейки» сети, в которой располагались группы кератиноцитов. Через 11 суток после посадки первичной клеточной взвеси из крупных конгломератов клеток, прикрепившихся ко дну чашки Петри, образовалась монослойная смешанная по составу культура, состоящая из фибробластов и кератиноцитов. Клетки продуцировали коллаген.

Таким образом, из утильных тканей, иссеченных при первичной хирургической обработке раны, можно получить жизнеспособные клетки, образующие при культивировании органоспецифические колонии. Это подтверждает возможность использования утильных тканей в качестве источника аутологичных прогениторных клеток кожи.

Способ комбинации аутологичной кожи с ДМ в ране пациента.

Показанием к применению данного способа являются обширные травматические раны с дефектом мягких тканей. При этом обязательным условием для осуществления данного способа является наличие достаточного количества утильных лоскутов кожи.

Абсолютным противопоказанием являются укушенные раны в остром периоде (первые трое суток с момента травмы согласно Приложению №2 к приказу МЗ РФ №297 от 07.10.1997).

Относительным противопоказанием является наличие на дне раны крупных сосудисто-нервных пучков, костей или внутренних органов, когда требуется предварительная пластика мягкими тканями.

Первым этапом производят ПХО в операционной с соблюдением правил асептики и антисептики по стандартной методике с иссечением краев.

Сразу после иссечения кожу тщательно обрабатывают растворами антисептиков, препарируют от остатков подкожно-жировой клетчатки. С сохранением стерильности, измельчают в лотке скальпелем или ножницами до размеров фрагментов 1-2 мм.

Стерильный ДМ, изготовленный из кожи донора-трупа, с соблюдением правил асептики и антисептики перфорируют скальпелем в лотке для обеспечения оттока раневого отделяемого, например, с частотой 1 перфорация длиной 5 мм на 1 см².

Перфорированный ДМ укладывают на дно раны таким образом, чтобы между краями перфораций был диастаз, в перфорации вносят все приготовленные фрагменты утильной кожи пациента, равномерно распределяют, затем рану укрывают стерильной марлевой повязкой. Первую перевязку производят через 48 часов, оценивают наличие признаков воспаления, характер и количество раневого отделяемого, степень фиксации ДМ и фрагментов кожи. В дальнейшем перевязки производят каждые 48 часов.

Способ комбинации ДМ и аллогенных ММСК.

Для стимуляции процессов регенерации в укушенных ранах и при необходимости стимуляции процессов регенерации в отсроченном периоде был разработан способ комбинации ДМ и аллогенных ММСК. Также этот способ может быть применен и при поступлении пациента в стационар. Показанием к применению данного способа являются обширные травматические раны с дефектом мягких тканей различного генеза.

Относительным противопоказанием является наличие на дне раны крупных сосудисто-нервных пучков, костей или внутренних органов, когда требуется предварительная пластика мягкими тканями. Наличие острого гнойно-воспалительного процесса в области раны.

Суспензию аллогенных клеток готовят в культуральном блоке с соблюдением правил асептики и антисептики. Используют ММСК третьего-четвертого пассажа, полученные из костного мозга доноров. Раствором трипсина-версена клетки отделяют от культурального пластика и готовят суспензию клеток в 0,9% растворе NaCl. Для оценки качества ММСК проводится цитометрическое исследование. Клеточный материал пригоден для трансплантации в случае, если подтверждена его биологическая и инфекционная безопасность, в нем содержится 80-95% неповрежденных клеток и более 80% клеток с фенотипом CD105⁺CD90⁺CD45^-CD34^-. В случае признания культуры ММСК пригодной для трансплантации готовят инъекционную форму препарата в 0,9% растворе NaCl с концентрацией клеток в суспензии 0,5-2 млн/мл, предпочтительно 1 млн/мл. Препарат ММСК пригоден для применения в течение 6 часов.

В случае укушенной раны проводят ПХО в условиях операционной с соблюдением правил асептики и антисептики согласно Приложению №2 к приказу МЗ РФ №297 от 07.10.1997, которая заключается в обильном промывании раны струей воды с мылом (или любым моющим средством), обработке краев раны 70° спиртом. Затем производится трансплантация аллогенных ММСК в виде суспензии, содержащей 0,5-2 млн ММСК в 1 мл, предпочтительно 1 млн/мл, в дно раны и окружающие мягкие ткани при помощи инъекций на глубину 0,1-0,3 см с частотой 10 инъекций на 1 см², объем каждой инъекции 0,05-0,1 мл. Дно раны укрывают стерильным ДМ, моделированным по форме раны, с перфорациями для создания оттока раневого отделяемого, предпочтительно с частотой 1 перфорация длиной 5 мм на 1 см², затем рану укрывают стерильной марлевой повязкой.

При применении способа в отсроченном периоде манипуляцию осуществляют в перевязочной с соблюдением правил асептики и антисептики. У пациента снимают повязку с раны. Рану трехкратно обрабатывают стерильными марлевыми тампонами, смоченными 5% водным раствором хлоргексидина, промокают стерильным сухим марлевым тампоном. С целью предотвращения контаминации раны кожу вокруг раны трехкратно обрабатывают 0,5%спиртовым раствором хлоргексидина, избегая его попадания в рану. Затем с соблюдением правил асептики и антисептики производится трансплантация аллогенных ММСК в дно раны и окружающие мягкие ткани при помощи инъекций суспензии, содержащей 0,5-2 млн ММСК, предпочтительно 1 млн/мл в 1 мл раствора на глубину 0,1-0,3 мм с частотой 10 инъекций на 1 см², объем каждой инъекции 0,05-0,1 мл. Затем дно раны укрывают стерильным ДМ, моделированным по форме раны, с перфорациями для создания оттока раневого отделяемого, предпочтительно с частотой 1 перфорация длиной 5 мм на 1 см², затем рану укрывают стерильной марлевой повязкой. Первую перевязку производят через 48 часов, оценивают наличие признаков воспаления, характер и количество раневого отделяемого, степень фиксации дермального матрикса. В дальнейшем перевязки производят каждые 48 часов.

Клинические примеры применения предлагаемого способа

Клинический пример 1

Больной К. 43 лет поступил в НИИ СП с диагнозом: обширная рвано-укушенная лоскутная рана средней трети правой голени.

Дном раны являлась подкожно-жировая клетчатка (ПЖК). Основание лоскута направлено дистально. Лоскут представлял собой слой кожи и ПЖК площадью 20 см².

При поступлении согласно приложению №2 к приказу МЗ РФ №297 от 07.10.1997 был произведен туалет раны мыльным раствором и растворами антисептиков, рана укрыта стерильными салфетками, смоченными 5% водным раствором хлоргексидина.

На первые сутки с момента травмы с целью стимуляции регенерации, профилактики ишемических осложнений в лоскуте с соблюдением правил асептики и антисептики была произведена трансплантация аллогенных ММСК в виде суспензии, содержащей 1 млн ММСК в 1 мл в дно раны и окружающие мягкие ткани при помощи инъекций на глубину 0,1-0,3 мм с частотой 10 инъекций на 1 см и создания оптимальной микросреды в ране на дно раны уложен стерильный перфорированный ДМ. Больной получал комплексную терапию, в ходе которой ему проводилась антибактериальная терапия, ГБО, ФЗТ.

После удаления ДМ на 5-е сутки с момента трансплантации дно раны покрыто яркими грануляциями, лоскут телесного цвета плотно спаян с подлежащими тканями.

На 6-е сутки с момента травмы с целью раннего закрытия раневого дефекта в перевязочной с соблюдением правил асептики и антисептики была произведена комбинированная пластика раны: стерильный ДМ, изготовленный из кожи донора-трупа, перфорировали с частотой 1 перфорация длиной 5 мм на 1 см² для создания путей оттока раневого отделяемого и уложили на дно раны таким образом, чтобы между краями перфораций был диастаз, в перфорации, в шахматном порядке, внесли аутологичную кожу пациента, затем рану укрыли стерильной марлевой повязкой.

На 3 сутки с момента пластики отмечалось приживление кожных фрагментов в перфорациях ДМ, отмечена выраженная краевая эпителизация под ДМ.

На всех этапах лечения производили взятие посевов из раны. По результатам посевов роста патологической микрофлоры не выявлено.

Клинический пример 2

Пациентка П. 70 лет поступила в НИИ СП с диагнозом: множественные укушенные раны конечностей, в том числе обширная лоскутная рана с дефектом кожи по тыльной поверхности правого предплечья с дистальным основанием лоскута. Дном этой раны являлись неповрежденные сухожилия разгибателей пальцев кисти, мышцы предплечья и размозженная подкожно-жировая клетчатка.

В отделении больная получала комплексное лечение: антибактериальную терапию, ГБО, ФЗТ, проводились ежедневные перевязки ран. На 7-е сутки нахождения в стационаре, несмотря на проводимое лечение, отмечено нарастание ишемии кожного лоскута в нижней трети предплечья.

С целью стимуляции регенерации и профилактики ишемических осложнений в лоскуте с соблюдением правил асептики и антисептики была произведена трансплантация аллогенных ММСК в виде суспензии, содержащей 1 млн ММСК в 1 мл в дно раны и окружающие мягкие ткани при помощи инъекций на глубину 0,1-0,3 мм с частотой 10 инъекций на 1 см². Затем дно раны укрыли стерильным ДМ, моделированным по форме раны, с перфорациями для создания оттока раневого отделяемого, частотой 1 перфорация длиной 5 мм на 1 см², затем рану укрыли стерильной марлевой повязкой.

На пятые сутки после трансплантации клеток отмечена положительная динамика: область ишемии уменьшилась, дно раны на 80% покрыто грануляционной тканью, выражена краевая эпителизация. После заполнения раны предплечья яркой мелкозернистой сочной грануляционной тканью при выраженной краевой эпителизации с целью закрытия дефекта произведена аутодермопластика свободным кожным лоскутом. На момент пластики площадь раны составляла 48 кв.см. Первая перевязка произведена на 6-е сутки после аутодермопластики. Результат аутодермопластики расценен как хороший - пересаженный кожный лоскут прижился на 90%. На 7-е сутки после операции пациентка выписана на амбулаторное долечивание.

Отдаленный результат лечения оценивался через 8 месяцев с момента травмы. Кожа области бывшей раны подвижна без трофических нарушений и деформирующих рубцов. Функция руки восстановлена полностью.

Таким образом, предложенный способ позволяет сократить сроки регенерации раны за счет стимулирования процессов эпителизации (более ранняя активация пролиферации и миграции кератиноцитов), сокращения воспалительной фазы, а также ускорения формирования и созревания грануляционной ткани.

Представленная группа изобретений относится к медицине, а именно к дерматологии и хирургии, и может быть применено для восстановления кожного покрова у пациентов с обширными травматическими ранами с дефектом мягких тканей. Для этого выполняют иссечение утильной кожи по краям раны. Иссеченную кожу препарируют от остатков подкожной жировой клетчатки и измельчают до фрагментов площадью 1-2 мм². Затем моделируют дермальный матрикс, изготовленный из кожи донора-трупа, по форме раны. Перфорируют дермальный матрикс (ДМ) для создания путей оттока раневого отделяемого и укладывают на дно раны таким образом, чтобы между краями перфораций был диастаз. В перфорации в шахматном порядке вносят фрагменты утильной кожи пациента. Затем рану укрывают стерильной марлевой повязкой. Другим изобретением является трансплантация в дно раны аллогенных мезенхимальных мультипотентных стромальных клеток (ММСК) в виде суспензии при помощи инъекций на глубину 0,1-0,3 мм с частотой 10 инъекций на 1 см². Объем каждой инъекции составляет 0,05-0,1 мл. Затем моделируют дермальный матрикс, изготовленный из кожи донора-трупа, по форме раны. Перфорируют его для создания путей раневого отделяемого, укладывают на дно раны. Затем рану укрывают стерильной марлевой повязкой. Заявленные изобретения обеспечивают оптимизацию заживления раны кожи и мягких тканей за счет стимуляции процессов регенерации стволовыми клетками, в том числе с алло- и ауто-ММСК и резидентными столовыми клетками. Такой результат достигается за счет использования ДМ как оптимального биосовместимого носителя для клеток и для создания необходимой микросреды в ране, стимулирования процессов регенерации за счет комбинации с гомогенизированной аутологичной кожей или инъекциями аллогенных ММСК в область раны. 2 н. и 3 з.п. ф-лы, 2 пр.

1. Способ восстановления кожного покрова у пациентов с обширными травматическими ранами с дефектом мягких тканей, включающий иссечение утильной кожи по краям раны, иссеченную кожу препарируют от остатков подкожной жировой клетчатки и измельчают до фрагментов площадью 1-2 мм², моделируют дермальный матрикс, изготовленный из кожи донора-трупа, по форме раны, перфорируют для создания путей оттока раневого отделяемого и укладывают на дно раны таким образом, чтобы между краями перфораций был диастаз, в перфорации в шахматном порядке вносят фрагменты утильной кожи пациента, затем рану укрывают стерильной марлевой повязкой.

2. Способ по п.1, в котором трансплантат перфорируют по всей поверхности с частотой одна перфорация 5 мм на 1 см².

3. Способ восстановления кожного покрова у пациентов с обширными травматическими ранами с дефектом мягких тканей, включающий трансплантацию в дно раны аллогенных мезенхимальных мультипотентных стромальных клеток (ММСК) в виде суспензии при помощи инъекций на глубину 0,1-0,3 мм с частотой 10 инъекций на 1 см, объемом каждой инъекции 0,05-0,1 мл, моделируют дермальный матрикс, изготовленный из кожи донора-трупа, по форме раны и перфорируют для создания путей раневого отделяемого, укладывают на дно раны, затем рану укрывают стерильной марлевой повязкой.

4. Способ по п.3, в котором трансплантат перфорируют по всей поверхности с частотой одна перфорация 5 мм на 1 см².

5. Способ по п.3, в котором суспензия ММСК содержит 1 млн ММСК в 1 мл.