Способ определения сенсибилизирующих свойств ксенобиотиков. Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной аллергологии, и может быть использовано для выявления сенсибилизирующих свойств ксенобиотиков в эксперименте.
Известен способ определения in vitro реагинов или непрямая реакция дегрануляции базофилов, в котором базофилы выполняют роль клеток - мишеней, реагирующих на образующийся комплекс реагинов испытуемой сыворотки заведомо больного человека и добавляемого в систему in vitro аллергена. Под воздействием такого комплекса развивается обратимая реакция, сопровождающаяся экскрецией биогенных аминов и выражающаяся уменьшением окраски гранул, изменением формы клетки, вакуолизацией протоплазмы, гиперхромазией.
Недостатками этого способа являются следующие факторы:
не учитывается ход естественных превращений ксенобиотика в организме, что может стать причиной ложноотрицательных и ложноположительных результатов;
для постановки реакции важна выраженность аллергического процесса в организме человека, так как на доклинических стадиях тест редко бывает положительным;
возникает необходимость получения сыворотки крови больного человека, хранения ее и использования не более чем через 24 ч с момента получения;
в реакции применяются только водорастворимые химические вещества.
Наиболее близким по технической сущности к данному способу является выбранный в качестве прототипа способ - реакция дегрануляции тучных клеток по Шварцу, в котором тучные клетки выполняют роль клеток-мишеней, реагирующих на образовавшийся комплекс реагинов испытуемой сыворотки больного и добавляемого в систему in vitro аллергена. Под воздействием такого комплекса развивается обратимая реакция, сопровождающаяся экскрецией биогенных аминов и выражающаяся уменьшением окраски гранул, изменением формы клетки, вакуолизацией протоплазмы, гиперхромазией. Реакция ставится с сывороткой больного человека.
Недостатками этого способа являются следующие:
не учитывается естественный метаболизм ксенобиотиков в организме, в результате чего прямой контакт исходной формы ксенобиотика (без его метаболизма) с тучными клетками может обусловить неспефифическую цитотоксическую реакцию последних;
в случае тестирования на сенсибилизирующий эффект химического вещества, обладающего свойствами либератора биогенных аминов, возможно получение ложноположительных результатов за счет прямого дегранулирующего влияния аллергена.
Целью предложенного способа является повышение точности способа определения сенсибилизирующих свойств ксенобиотиков.
Поставленная цель достигается тем, что реакция дегрануляции тучных клеток производится в системе in vivo. Предварительно трехкратно с интервалом через день экспериментальным животным производится базовая сенсибилизация чужеродным белком по 0,5 мл внутрибрюшинно, другой контрольной группе животных одномоментно с созданием базовой сенсибилизации путем введения чужеродного белка вводится растворитель исследуемого вещества по 0,5 мл в другом шприце, внутрибрюшинно трехкратно с интервалом через день. Экспериментальным группам животных на фоне сенсибилизации, создаваемой введением чужеродного белка, осуществляется введение тестируемого вещества в исследуемой дозе, внутрибрюшинно, в другом шприце, трехкратно, с интервалом через день. Через 14 дн от начала эксперимента всем животным внутрибрюшинно вводится по 5 мл теплого /37оС/ раствора "Гемоцел", после легкого массажа в течение 2 мин брюшной стенки производится забой животных методом смещения шейных позвонков. По средней линии брюшной стенки ножницами делается разрез длиной 2 см, тушка животного переворачивается разрезом вниз и собирается экссудат, стекающий с кишечника в смоченную гепарином пробирку.
На предметное стекло, предварительно окрашенное 0,3% -ным раствором нейтрального красного на абсолютном спирте, наносятся ингредиенты системы: перитонеальная взвесь 0,05 мл и лошадиная сыворотка (чужеродный белок) в объеме 0,05 мл (т. е. при соотношении 1: 1), капли осторожно смешиваются, распластываются на стекле, инкубируются в термостате при 37о в течение 15 мин, затем быстро высушиваются на воздухе. Учет результатов реакции осуществляется путем подсчета ста тучных клеток с вычислением процента клеток с реакцией на аллерген. Тест считается отрицательным, если процент дегранулирующих клеток в эксперименте по сравнению с контролем не превышает 10% .
Сопоставительный анализ заявляемого решения с прототипом показывает, что заявляемый способ отличается от известных тем, что с целью повышения точности способа ксенобиотики, тестируемые на сенсибилизирующие свойства, вводятся животным предварительно, т. е. оценивается действие in vivo.
Известны технические решения, в которых постановка реакции дегрануляции тучных клеток с целью изучения сенсибилизирующих свойств ксенобиотиков производится in vitro. Однако при указанном способе постановки реакции не воспроизводится естественный метаболизм ксенобиотика в организме, важна выраженность аллергического процесса в организме исследуемого человека, возможно тестирование лишь водорастворимых химических веществ. Указанные недостатки исключаются в заявленном техническом решении благодаря предварительному введению в организм животного тестируемого вещества на фоне базовой сенсибилизации и внесению в тест-систему чужеродного белка, составляющего основу базовой сенсибилизации.
Предлагаемый способ определения сенсибилизирующих свойств ксенобиотиков осуществлен следующим образом. Выделялись 3 группы экспериментальных и 2 группы контрольных животных:
Контрольная 1 - сенсибилизация у животных /крыс/ вызывалась внутрибрюшинным введением чужеродного белка /лошадиной сыворотки/ по 0,5 мл трехкратно, через день - 5 животных.
Контрольная 2 - параллельно с введением лошадиной сыворотки в другом шприце крысам вводится растворитель акрилатов - подсолнечное масло, не обладающее сенсибилизирующими свойствами, по 0,5 мл внутрибрюшинно, трехкратно, через день - 5 животных.
Экспериментальная 1 - на фоне базовой сенсибилизации, создаваемой введением чужеродного белка - лошадиной сыворотки, вводился другим шприцем ксенобиотик с не изученными сенсибилизирующими свойствами - бутилакрилат (БА) в дозе 1/4 ЛД50, что составляет 0,06 г в 0,5 мл подсолнечного масла - внутрибрюшинно трехкратно через день - 5 животных.
Экспериментальная 2 - на фоне базовой сенсибилизации лошадиной сывороткой вводился другим шприцем ксенобиотик с неизвестными сенсибилизирующими свойствами - метилметакрилат (ММА) в дозе 1/4 ЛД50, что составляет 0,13 г в 0,5 мл подсолнечного масла - внутрибрюшинно трехкратно через день - 5 животных.
Экспериментальная 3 - на фоне базовой сенсибилизации, создаваемой введением лошадиной сыворотки, вводились в других шприцах ксенобиотики с не изученными ранее сенсибилизирующими свойствами - БА и ММА в дозах по 1/4 ЛД50, в 0,5 мл растворителя - подсолнечного масла трехкратно внутрибрюшинно через день - 5 животных.
Через 14 дней от начала эксперимента всем животным внутрибрюшинно вводилось по 5 мл теплого /37оС/ раствора "Гемоцел", после легкого массажа в течение 2 мин брюшной стенки производился забой животных методом смещения шейных позвонков. По средней линии брюшной стенки ножницами делался разрез длиной 2 см, тушка животного переворачивалась разрезом вниз и собирался экссудат, стекающий с кишечника, в смоченную гепарином пробирку. На предметное стекло, предварительно окрашенное 0,3% -ным раствором нейтрального красного на абсолютном спирте наносились ингредиенты системы: перитонеальная взвесь и лошадиная сыворотка при соотношении 1: 1 /по 0,05 мл/, капли осторожно смешивались, распластывались на стекле, инкубировались в термостате при 37оС в течение 15 мин, затем быстро высушивались на воздухе. Учет результатов реакции осуществлялся путем подсчета ста тучных клеток с вычислением процента клеток с реакцией на аллерген. Полученные данные были обработаны методом математической статистики с использованием Т-критерия Стьюдента. В результате проведенных исследований получены следующие данные:
Контроль 1: M±м= 66,0±2,96.
Контроль 2: М±м= 66,4±2,96.
Экспериментальная группа 1 (БА) М±м= 81,6±1,61, Р<0,01.
Экспериментальная группа 2 (ММА) М±м= 78,0±2,72, Р<0,05.
Экспериментальная группа 3 (БА+ММА) М±м= 76,6±1,75, Р<0,05.
В данных исследованиях получены достоверно отличимые от контроля результаты, разница которых превышает 10% . Следовательно, параллельное введение чужеродного белка и акрилатов вызывает более выраженную сенсибилизацию экспериментальных животных.
Эксперимент проведен на 25 крысах.
Одинаковые показатели реакции обеих контрольных групп свидетельствует о том, что сенсибилизирующие свойствами у растворителя акрилатов - подсолнечного масла - отсутствуют.
Предлагаемый способ имеет следующие достоинства по сравнению с прототипом:
вследствие воспроизведения естественного метаболизма ксенобиотика в организме и отсутствия прямого контакта исходной формы ксенобиотика с тучными клетками исключается возможность появления неспецифической цитотоксической реакции тучных клеток на вводимое вещество;
исключается прямое дегранулирующее влияние ксенобиотика в случае наличия у него свойств либератора биогенных аминов, так как не происходит прямого контакта ксенобиотика с клетками-мишенями в тестируемой системе;
обеспечивается возможность проведения скрининг-тестирования химических веществ на экспериментальных животных;
обеспечивается возможность осуществлять эксперименты по выявлению закономерностей протекания реакций в зависимости от химических свойств соединений;
возможно тестирование не только водорастворимых химических веществ, но и жиро- и спирторастворимых.
Использование: в медицине, а именно в экспериментальной аллергологии. Сущность изобретения, предварительно трехкратно с интервалом через день контрольной группе животных производят базовую сенсибилизацию чужеродным белком - лошадиной сывороткой - по 0,5 мл внутрибрюшинно, другой контрольной группе животных одномоментно с созданием базовой сенсибилизации вводят в другом шприце растворитель ксенобиотиков - по 0,5 мл внутрибрюшинно трехкратно с интервалом через день. Экспериментальным группам животных на фоне сенсибилизации, создаваемой введением чужеродного белка - лошадиной сыворотки, осуществляют введение тестируемых на сенсибилизирующие свойства веществ в исследуемой дозе в 0,5 мл растворителя, внутрибрюшинно, трехкратно, с интервалом через день. Через 14 дней от начала эксперимента выделяют тучные клетки перитонеального экссудата животных. На предметное стекло, предварительно окрашенное 0,3% -ным раствором нейтрального красного на абсолютном спирте наносят ингредиенты системы: перитонеальную взвесь 0,05 мл и лошадиную сыворотку 0,05 мл, капли осторожно смешивают, распластывают на стекле, инкубируют в термостате при +37С 15 мин, высушивают на воздухе. Учет результатов реакции осуществляют путем подсчета ста тучных клеток с вычислением процента клеток с реакцией на аллерген. Тест считается отрицательным, если процент дегранулирующих клеток в эксперименте по сравнению с контролем не превышает 10% . Способ позволяет воспроизвести естественный метаболизм ксенобиотиков в организме, вследствие отсутствия прямого контакта тестируемого вещества с тучными клетками исключить возможность прямого цитотоксического действия и тестировать жиро- и спирторастворимые вещества.
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СЕНСИБИЛИЗИРУЮЩИХ СВОЙСТВ КСЕНОБИОТИКОВ путем выделения тучных клеток из биологической жидкости, приготовления из них тест-системы с последующей ее инкубацией и подсчетом с помощью микроскопа дегранулированных тучных клеток, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа, предварительно экспериментальному животному трехкратно через день вводят внутрибрюшинно тестируемое вещество на фоне базовой сенсибилизации, а выделение тучных клеток осуществляют из перитонеальной жидкости исследуемого животного, причем в тест-систему дополнительно перед инкубацией вводят лошадиную сыворотку в соотношении перитонеальная взвесь : лошадиная сыворотка 1 : 1 и при значении дегранулированных тучных клеток более 10% относительно контроля определяют наличие сенсибилизирующих свойств у ксенобиотиков.
